Revista nº 802

138 Iván Morales Secuenciación masiva de genes de hipoacusia do) en el exón 8 de este gen (c.2086C>T y c.2108G>A) mediante aná- lisis de ligamiento (20). Nuestro estudio muestra que este exón tiene baja cobertura en el 100% de las muestras y presenta un contenido de GC problemático según la bibliografía (61.51%). Por último, el gen P2RX2 está involucrado en el correcto funcionamiento de los canales iónicos P2X2 activados por ATP que se encuentran en las células sen- soriales y de soporte de la cóclea. Mediante un análisis de ligamiento, Faletra et al . han descrito una mutación sinsentido (c.1057C>G) que afecta a un residuo altamente conservado entre las especies (21). Esta mutación ocurre en el exón 10, el cual presenta baja cobertura en el 100% de las muestras de nuestro estudio. Además, esta secuencia presenta un contenido alto de GC (62.17%). DIAPH1 y KCNQ4 son otros de los genes destacados en nuestro estudio. Por un lado, el gen DIAPH1 codifica una proteína encargada de unirse a los extremos de actinas sin ramificar para reducir la ve- locidad de despolimerización y polimerización de estas regiones. La variante c.3634+1G>T causa DFNA1, enfermedad caracterizada por una hipoacusia progresiva que comienza desde la infancia. Esta va- riante ocurre cerca del extremo C-terminal, el cual interacciona con el N-terminal, produciendo la activación de DIA1, proteína que juega un papel importante en la morfología celular y la organización del citoes- queleto . Por otro lado, se ha descrito una variante (c.3610C>T) en el exón 27 que resulta en un incremento de la polimerización de actina, produciéndose microvellosidades alargadas (22). El exón próximo a esta región C-terminal (exón 27) tiene baja cobertura en el 100% de las muestras, consta de un elevado contenido de GC (71.55%) y la es- tructura que se puede originar durante la secuenciación es especial- mente compleja. Por otro lado, el gen KCNQ4 codifica un canal iónico de potasio que juega un papel fundamental en la fisiología de esta enfermedad autosómica dominante progresiva relacionada con hipoacusia de alta frecuencia. Kamada et al . (23) identificaron una deleción hete- rocigótica de 1 pb (211delC) en el exón 1 de KCNQ4 que daba lugar a un truncamiento de la proteína, perdiéndose los dominios trans- membrana. Los individuos afectados por esta mutación presentaban síntomas mucho menos severos que otros pacientes con mutaciones sinsentido en KCNQ4 . Nuestro estudio ha determinado que el exón 1 de KCNQ4 tiene baja cobertura en el 100% de las muestras, así como un alto contenido de GC (79.55%) y, de todos los exones afectados, es el que más estructuras secundarias presentaba en su secuencia. Veinte de los 24 exones de baja cobertura identificados pre- sentan un elevado contenido de GC (>60%). Estudios que respaldan este intervalo nosmuestran que el uso de tampones, aditivos (DMSO, betaína), métodos de purificación, el medio de carga y las condicio- nes de los ciclos no juegan un papel determinante en la calidad de la secuenciación estadísticamente significativo. Sin embargo, el uso de cebadores pequeños (<3 pmol) si produce una secuenciación con menos cobertura y peor calidad (24). Por otro lado, la presencia de es- tructuras secundarias de tipo horquilla, como las que observamos en los exones de DIAPH1 y KCNQ4 , dificultan la correcta secuenciación de estas regiones, tal y como se nos muestra en estudios realizados con plásmidos (25). Todos los exones presentaron, al menos, una hor- Gen Exón nBases %GC nBucles DIABLO 6 49 53,06 1 TBC1D24 6 222 67,57 1 CD164 6 174 66,67 1 WFS1 1 231 70,13 1 2 82 58,54 1 5 80 70,00 1 7 1811 61,51 2 CEACAM16 5 326 64,42 1 HOMER2 9 5 60,00 0 CRYM 8 167 68,86 1 COCH 2 47 74,47 1 P2RX2 1 172 72,09 1 4 75 64,00 1 10 497 62,17 1 KCNQ4 1 313 79,55 5 4 174 66,67 2 DIAPH1 15 715 58,90 1 27 116 71,55 * MYH14 1 404 72,77 * 26 171 67,25 1 31 756 57,94 1 32 212 67,45 1 MYO7A 20 218 70,18 1 37 157 66,24 2 Tabla 2. Estructura primaria y secundaria de los genes de hipoacusia no sindrómica dominante con exones “Ilegibles”. nBases: número de bases totales de la secuencia. %GC: porcentaje de bases GC de la secuencia. nBucles: número de estructuras secundarias encontradas en la secuencia. *: Estructura compleja. Figura 1. Estructuras secundarias destacables en algunos genes de hipoacusia no sindrómica autosómica dominante. Las secuencias fueron seleccionadas por el número de estructuras secundarias o la complejidad de estas. A: Exón 27 de DIAPH1. B: Exón 1 de KCNQ4. C: Exón 1 deMYH14.