Revista nº 802

146 Pedro Quintero Campos Caracterización Agarosas I y VII para uso en Ing. Tisular INTRODUCCIÓN La Ingeniería Tisular es una ciencia multidisciplinaria cuyo objetivo es el desarrollo de estrategias para la generación de órganos y tejidos completamente funcionales; estrategias que se basan en la interacción de tres componentes fundamentales como son: células, factores de crecimiento y andamios (1). La función del andamio es servir como soporte estructural y guía para la formación del nuevo tejido, proporcionando un am- biente en tres dimensiones, que facilite la adherencia, migración, proliferación y organización espacial tridimensional de las células, y por tanto juega un papel determinante en el crecimiento y dife- renciación celular (2). Alguno de los andamios utilizados en Ing- eniería Tisular son colágeno, fibrina y distintos tipos de polímeros naturales, ya que presentan propiedades similares a las de la ma- triz extracelular nativa (3). Estos biomateriales pueden extraerse de plantas, animales, algas o pueden ser sintetizados por micro- organismos (4). La agarosa es un polisacárido procedente de las algas marinas que tiene la capacidad de formar geles térmicamente reversibles (5). Estructuralmente es un polímero lineal que consiste en unidades al- ternas de D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa. Este polisacárido es soluble en agua a temperaturas por encima de 65ºC y, dependiendo del grado de sustituciones de hidroxietilo en sus cadenas laterales, gelifica en un rango de temperaturas comprendido entre 17-40ºC (6), dando lugar a distintos tipos de agarosas comerciales. Una vez que los geles de agarosa son estables no se vuelven a hacer líquidos hasta alcanzar temperaturas mayores a 65ºC. Esta característica en la que las temperaturas de fusión y gelificación son distintas recibe el nombre de histéresis térmica (7). Entre sus múltiples usos destaca su utilización para la obten- ción de geles para el cultivo de células en Ingeniería Tisular (8). La es- tructura física de dichos geles puede ser controlada usando distintas concentraciones de agarosa, lo que da lugar a diversos tamaños de poro. Los grandes poros y la baja rigidez mecánica de los geles a ba- jas concentraciones de agarosa pueden permitir la migración y pro- liferación de células (9). Entre sus aplicaciones en Ingeniería Tisular destaca su uso conjugado con fibrina para la obtención de hidrogeles de fibrina-agarosa que permiten la elaboración de tejidos artificiales como piel (10), córnea (11), mucosa oral (12) y nervio (13). Por otro lado, los geles de agarosa suelen también utilizarse, en Ingeniería Ti- sular, para la reparación del cartílago (14), ya que favorecen el creci- miento y la diferenciación de los condrocitos (15). Uno de los procedimientos más usados en histología es la in- clusión en parafina de las muestras, ya que permite su conservación sin la necesidad de poseer un equipo que las mantenga (16). Sin em- bargo, las características de la agarosa, sobre todo su baja tempera- tura de fusión, hace muy difícil el procesamiento de los constructos fabricados con este material para su estudio en histología. Por ello se hace necesario establecer una nueva metodología que permita el procesamiento de los geles de agarosa para su estudio. El objetivo del presente trabajo consiste en desarrollar un nuevo protocolo para la inclusión de geles de agarosa en parafina y, por otro lado, la carac- terización de dos tipos distintos de agarosa, Tipo I y Tipo VII, para su uso en Ingeniería Tisular. MATERIAL Y MÉTODOS Protocolo Procesamiento de Geles de Agarosa Elaboración de los geles Para la elaboración de los geles se partió de agarosa tipo VII al 2% (Sigma – Aldrich, Steinheim, Alemania) preparada en So- lución Tamponada con Fosfato (PBS) (Sigma-Aldrich). La agarosa fue calentada hasta hacerse líquida y se distribuyó en placas de Petri de 55mm. Una vez gelificado, se obtuvieron punchs de 8 mm del gel. Evaluación de los protocolos Una vez obtenidos los geles, fueron procesados de acuerdo a cuatro protocolos, basados en la metodología habitual de pro- cesamiento para inclusión en parafina (17), y que se diferencian en el tiempo de deshidratación e inclusión (Tabla 1). Tras la inclusión en parafina, se obtuvieron cortes de 5 µm que fueron teñidos con Hematoxilina-Eosina para poder determi- nar cuál era el procedimiento idóneo. Caracterización de Agarosa Tipo I y Tipo VII Cultivo de Condrocitos Los condrocitos se obtuvieron a partir de biopsias de tejido car- tilaginoso de rata. Las muestras fueron fragmentadas mecánicamente en pequeños trozos e incubadas a 37.5ºC en una solución estéril de colagenasa tipo I de Clostridium hystoliticum (Gibco BRL Life Techno- logies Ref. 17100-017, Karlsruhe, Alemania) al 2% en medio de cultivo DMEM durante 7 horas. Posteriormente los condrocitos fueron aisla- dos mediante centrifugación y cultivados enmedio de expansión para condrocitos [DMEM-F12 (GIBCO) suplementado con Suero Fetal Bovi- no al 10% (FBS, Sigma-Aldrich), Solución Antibiótica al 1% (100 U/ml de penicilinaG, 100μg/ml Estreptomicina y 0,25μg/ml de anfotericina B, Sigma – Aldrich, Steinheim, Alemania) y 2mM de L-glutamina (Sig- ma-Aldrich, Alemania)] a 37.5ºC y 5% de dióxido de carbono. El medio de cultivo se renovó cada 3 días y los condrocitos se expandieron hasta el pase VI para su utilización en la elaboración de los constructos. Fabricación de los geles Los geles de agarosa se elaboraron utilizando dos tipos distintos: Agarosa Tipo I y Tipo VII (Sigma-Aldrich). La agarosa Tipo I es un tipo de agarosa comercial cuya temperatura de gelificación está comprendida entre los 34.5-37.5ºC, mientras que la agarosa Tipo VII o Agarosa Low Gelling Temperature, se caracteriza por tener una temperatura de ge- lificación que oscila entre los 24-28ºC. En Ingeniería Tisular la agarosa normalmente utilizada para la elaboración de constructos es de tipo VII ya que su baja temperatura de gelificación permite que las célu- las no disminuyan su viabilidad. En este caso, para caracterizar ambos tipos de agarosa y determinar la viabilidad celular en cada una de las condiciones anteriormente citadas, se fabricaron geles a dos concen- traciones, 2% y 2.5%, partiendo de agarosa estéril al 4% preparada en Solución Tamponada con Fosfato (PBS) (Sigma-Aldrich). Para ello se prepararon 3 mL de mezcla para cada condición que contenía agarosa estéril líquida al 4%, y condrocitos en medio condrogénico [DMEM- F12 (GIBCO) suplementado con Solución Antibiótica al 0.1%, 2mM de Piruvato de sodio (GIBCO), ITS al 0.1%, 4 µM de Ácido ascórbico (Sig- ma – Aldrich), 10 ng/mL de TGF-β1, 10 µM de Dexametasona (Sigma – Aldrich) y 0.35 mMde L-Prolina (Sigma-Aldrich)]. Tras homogeneizar cuidadosamente, esta mezcla se distribuyó en placas de 12 pocillos (3 pocillos por condición) en alícuotas de 1 mL que contenían 100.000 Tabla 1. Protocolos para el Procesamiento de Geles de Agarosa T 1 T 2 T 3 T 4 Fijación FORMALDEHÍDO 3.7% 24 horas 24 horas 24 horas 24 horas Deshidrata- ción ALCOHOL 50% 10 min 20 min 25 min 30 min ALCOHOL 70 % 10 min 20 min 25 min 30 min ALCOHOL 70% 10 min 20 min 25 min 30 min ALCOHOL 95% 10 min 20 min 25 min 30 min ALCOHOL 95% 10 min 20 min 25 min 30 min ALCOHOL 95% 10 min 20 min 25 min 30 min ALCOHOL 100% 10 min 20 min 25 min 30 min ALCOHOL 100% 10 min 20 min 25 min 30 min ALCOHOL 100% 10 min 20 min 25 min 30 min XILOL 10 min 20 min 20 min 20 min XILOL 10 min 20 min 20 min 20 min Inclusión PARAFINA 10 min 20 min 25 min 30 min PARAFINA 10 min 20 min 25 min 30 min