Revista nº 802

147 Pedro Quintero Campos Caracterización Agarosas I y VII para uso en Ing. Tisular células. Una vez gelificado, se le añadió medio condrogénico para fa- vorecer el desarrollo de los condrocitos y este se renovó cada 2 días. Se realizaron 3 placas exactamente iguales para realizar los estudios a los 2, 8 y 16 días. Las placas semantuvieron en un ambiente de 37.5ºC y 5% de CO 2 . Liberación de ADN Una forma de estudiar la muerte celular es mediante la evalua- ción de la permeabilidad de la membrana celular. El ADN liberado se cuantificó en un espectrofotómetro UV-Vis NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific) por espectrofotometría a λ = 260-280 nm, siguiendo el método descrito previamente por Rodríguez-Arco (18). El sobrena- dante del medio de cultivo se colocó en tubos Eppendorf para la cu- antificación de ADN. Para este análisis se utilizaron tres geles de cada modalidad y se registraron tres determinaciones para cada uno (n = 9 para cada condición). Como control negativo las células fueron trata- das con Triton X-100 al 2% durante 10 minutos, introduciéndose una liberación elevada de ADN debido al daño irreversible en las membra- nas plasmáticas y nucleares. Se utilizó agua destilada y medio de cul- tivo como controles para la técnica de ensayo. Evaluación Histológica Para los análisis histológicos e inmunohistoquímicos, los geles fueron procesados utilizando el Protocolo T 3 descrito con anterioridad. Una vez que los geles fueron incluidos en parafina, se obtuvieron sec- ciones transversales de 5 μm de cada uno de ellos. Los cortes se tiñe- ron con azul Alcian y se contrastaron conNuclean Fast Red (19) para su observación al microscopio y obtener el área celular. Para estudiar el comportamiento celular, se analizarondiferentes procesos celulares mediante técnicas inmunohistoquímicas (13). Se utilizó el antígenonuclear de células enproliferación (PCNA) para iden- tificar las células proliferantes (20). También, se utilizó el anticuerpo frente a la Vimentina para identificar aquellas células que mantenían la integridad física (21). Para cada reacción inmunohistoquímica, se utilizaron controles para asegurar el correcto funcionamiento de los anticuerpos. Todos los procedimientos se realizaron bajo las mismas condiciones para asegurar la reproducibilidad de los resultados. Estudios de compresión Para realizar los estudios de compresión de los distintos geles se utilizó un sistema electromecánico para ensayos demateriales Instron, Modelo 3345-53327. Se utilizaron geles sin células de ambos tipos de agarosas a concentraciones del 2% y 2.5% para realizar las medidas. Para obtener resultados fiables, la compresión se realizó suavemen- te de modo que la fuerza normal que actuaba sobre la muestra era siempre inferior a 0.05 N y la separación placa-placa era de 3 mm. El módulo de Young (E) se calculó como la tangente de la porción lineal inicial de la curva esfuerzo-deformación de cada prueba experimental, mientras que los valores del esfuerzo a rotura (σ) y de la deformación a rotura (ε) se determinaronmediante la selección del punto de la curva de esfuerzo-deformación donde se produjo la fractura. Tratamiento estadístico Los datos obtenidos se analizaron, para la presencia de valores atípicos, usando el test de Grubb (método ESD). Los análisis estadísti- cos se llevaron a cabo utilizando el programa informático Statgraphics Centurion XVI v.16.1.03 mediante ANOVA Simple. Seguidamente, se realizó un test de Tukey para la comparación entre grupos significati- vamente diferentes, siendo considerados estadísticamente diferentes cuando p<0.05. RESULTADOS Protocolo Procesamiento de Geles de Agarosa Los geles de agarosa procesados mediante los protoco- los T 2 , T 3 y T 4 nos permitieron obtener cortes de los mismos tras la inclusión en parafina, a diferencia de los geles some- tidos al protocolo T 1 . En estos últimos, los geles incluidos en parafina presentaron cierta dureza que impedía el corte de los mismos. Con microscopía óptica se observó una estructura fibrilar tanto en T 2 como en T 3 , y que estaba ausente en T 4 . (Figura 1) Caracterización de Agarosa Tipo I y Tipo VII Liberación de ADN El análisis por espectrofotometría de la liberación de ADN (Figura 2), como resultado del daño irreversible en la membrana celular, pone de relieve que la liberación de ADN es mayor en los geles de agarosa Tipo I en relación con la agarosa Tipo VII al 2% y 2.5%, respectivamente, a los 2, 8 y 16 días de cultivo. Mediante el tratamiento estadístico de los resultados se observó que existía una diferencia estadísticamente significativa de la liberación de ADN entre las distintas condiciones de cultivo (Tipo de agarosa y concentración) con un nivel del 95.0% de confianza. Para los días 2 y 8, mediante el Test de Tuckey, se distinguieron dos grupos ho- mogéneos correspondientes a cada tipo de agarosa independien- temente de la concentración utilizada. Mientras que para el día 16 dicho test estableció dos grupos homogéneos, uno formado por la agarosa tipo I y la condición agarosa tipo VII al 2.5%, y otro por la condición agarosa tipo VII al 2%. Evaluación Histológica El análisis del área celular, en cada una de las condiciones y en los distintos tiempos, puso de relieve en el día 2 diferencias estadísticamente significativas entre el tamaño y las condiciones de cultivo, identificándose dos grupos (Figura 4, A), uno formado por la agarosa Tipo I al 2% donde el tamaño es superior, y otro grupo formado por las condiciones restantes. En el día 8 (Figura 4, B) no existían diferencias estadísticamente significativas entre el tamaño y las condiciones de cultivo, identificándose un solo gru- po homogéneo. Mientras que en el día 16 (Figura 4, C) sí existían diferencias estadísticamente significativas entre el tamaño y las condiciones de cultivo, identificándose tres grupos homogéneos. El test de Tuckey estableció que la agarosa tipo VII al 2% formaba parte tanto del grupo “Agarosa tipo VII al 2.5%” como del grupo “Agarosa tipo I al 2%.” A Los resultados obtenidos de los análisis inmunohistoquími- cos resultaron ser positivos tanto para PCNA (Figura 3, A) como Vimentina (Figura 3, B). Estudios de compresión Tras la realización de los estudios de compresión se obtuvo el módulo de Young o módulo de elasticidad y la Fuerza en el pun- to de rotura para cada una de las condiciones (Tabla 2). Como se puede observar el módulo de Young es más pequeño en los geles Figura 1. Imágenes obtenidas por microscopía de los cortes de los geles a los que se les realizó los protocolos de procesamiento T2, T3 y T4 a los aumentos 4x y 40x.