Revista nº 805

127 Víctor Carriel Membrana de huevo como matriz celular Actualidad Médica · Número 805 · Septiembre/Diciembre 2018 Páginas 126 a 129 diversas moléculas de la MEC regulan procesos celulares como proliferación, migración, diferenciación y/o muerte celular (3,5). Es por ello que en ingeniería tisular se utilizan diversos biomateriales para recrear la estructura y composición molecular de la MEC nativa de los tejidos a regenerar o reemplazar (6). Dentro de lasmoléculas de interés para ingeniería tisular destacan las fibras de colágeno, las fibras elásticas y glicoproteínas como laminina o fibronectina, de las cuales se han logrado generar diversos hidrogeles y biomateriales (7,8). Además, la ingeniería tisular tiene por objetivo la búsqueda de alternativas terapéuticas para la reparación, sustitución o mejora de los tejidos y órganos dañados (6). Es por eso que la MEC derivada de la MCH emerge como unmaterial natural que podría servir de sustrato estructural para la construcción de tejidos y órganos (3). La comunidad científica ha hecho grandes avances en el estudio de la MCH y sus posibles aplicaciones (9) pero es necesario una caracterización ex vivo del biomaterial con el fin de determinar su potencialidad utilidad como biomaterial en la ingeniería tisular. Por ello, el objetivo del trabajo es evaluar la potencial utilidad de las membranas de huevo como posible biomaterial para aplicaciones en ingeniería tisular. Para ello, se cultivaron fibroblastos de mucosa oral que posteriormente se implantaron en membrana laxa (MCH2) y membrana densa (MCH1) de cáscara de huevo. Transcurrido varios días en cultivo, se procedió al estudio del comportamiento de fibroblastos humanos mediante técnicas histológicas. MATERIALES Y MÉTODOS Aislamiento, cultivo y siembra de los fibroblastos humanos Las células se aislaron y cultivaron tal y como se ha publicado previamente (10). Brevemente, se usó una solución de Colagenasa tipo I de Clostridum hystoliticum al 2% a 37ºC durante 10 a 12 horas para digerir la matriz extracelular de muestras de mucosa oral humana. Las células se recogieron con una centrifugación a 1000 rpm durante 10 minutos. El medio de cultivo fue medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y un 1% de antibióticos/antimicóticos. Las células se subcultivaron usando una solución de tripsina 0,5g/L y EDTA (Ácido etilendiaminotetraacético) 0,2g/L (Sigma Aldrich). Todas las células usadas en este estudio corresponden a los cinco primeros pases celulares (11). Posteriormente las células se sembraron en membranas de huevo durante 7 días. Evaluación microscópica de los fibroblastos en las membranas de huevo Después de este tiempo. las muestras fueron fijadas en formalina al 10% e incluidas en parafina. Posteriormente se hicieron cortes de 5 um que fueron teñidos con las siguientes tinciones histoquímicas: hematoxilina y eosina, picrosirius (12), azúl alcián y orceina. Una vez aplicadas las tinciones los cortes se fotografiaron a 100X, 200X y 400X con un microscopio óptico Nikon Eclipse 90i ((Nikon Corp., Tokyo, Japan) RESULTADOS Estudio de los componentes estructurales generales La tinción de Hematoxilina Eosina reveló unas estructuras basófilas unidas a las membranas de manera diferente en la MCH1 y en la MCH2. Se observa una clara diferencia estructural en cuanto a estas dos membranas; la MCH1 presenta una organización simple de manera lineal donde se pueden detectar ciertas fragmentaciones a lo largo de la misma, así como falta de compactación. Sin embargo, la MCH2 presenta una organización estructural más compleja y desordenada debido a un enrollamiento sobre sí misma generando ovillos. Existe una diferencia entre la distribución celular de la MCH1 y la MCH2, en la MCH1 como muestra la figura 1 las células están unidas entre ellas formando pequeñas aglomeraciones celulares y a su vez unidas a una región de la membrana, confirmando la interacción célula-biomaterial. El análisis de la MCH2 reveló la presencia de estructuras basófilas distribuidas de manera dispersa entre los meandros generados por los ovillos (figura 1). Estudio de las fibras de colágeno La tinción de Picrosirius pone en manifiesto la presencia y distribución del colágeno. La MCH1 presenta una tinción positiva de manera homogénea a lo largo de su estructura lineal y simple. Por otro lado, la tincióndeMCH2es positiva y heterogénea en cuanto intensidad ya que se aprecia una diferencia entre la capa externa con respecto la interna que genera más ovillos como se puede apreciar en la imagen deMCH2. Estudio de los proteoglicanos El estudiode la presencia de proteoglicanos se realizómediante la técnicadeAzulAlcian.Enlapartemáslaxadelamembrana(MCH1)hubo positividad que se distribuyó principalmente en la matriz extracelular del tejido conjuntivo subyacente al epitelio, delimitando una estructura en red con espacios en su interior. En cambio, el resultado de la tinción en la partemás densa de lamembrana (MCH2) fue negativo. Estudio de las fibras elásticas El análisis de la presencia de fibras elásticas se llevó acabó mediante la tinción de Orceína, que resultó negativo en ambos tipos de membrana de cáscara de huevo. DISCUSIÓN Como hemos comprobado en los resultados de la tinción con Hematoxilina Eosina, las células son capaces de adherirse Figura 1.