Revista nº 812

López-Cepero JM, et al. | Hematoxilina férrica de M. Heidenhain en cortes semifinos Actual Med. 2021; 106(812): 24- 29 25 rante no lo ceden fácilmente. La imagen microscópica, por tanto, depende de la facilidad de tinción (afinidad por el sustrato) pero también de la cantidad máxima de colorante (saturación de colorante) unido a algunas estructuras y de la compactación o fuerza de adhesión del colorante al sustrato (resistencia a la extracción). El mecanismo de tinción no es simple (5). Su mecanismo químico de afinidad por un sustrato concreto, es por tanto muy complejo y, en la práctica, muy difícil de averiguar. Sabemos que tiñe la croma- tina uniéndose al DNA, pero también por su compo- nente histónico, como el carmín-bórax de Grenacher (1879), (un colorante ácido) que también tiñe los nú- cleos (8). Modificando la fijación y las condiciones de ejecución pueden teñirse los centriolos, las mitocon- drias, numerosos tipos de gránulos de secreción, liso- somas, fagolisosomas, citoesqueleto (queratinas), y al- gunos pigmentos (lipofuchsina) e inclusiones, pero en cambio no es posible teñir la región del Golgi, las áreas de retículo endoplásmico y lípidos. La utilidad de esta técnica se basa precisamente en proporcionar distintos grados de contraste a diferentes porciones del núcleo y del citoplasma, dibujando una imagen muy particular de cada tipo de célula. Esto permite agruparlas por se- mejanza e identificarlas por su patrón de tinción. La técnica original no necesita de ninguna contratin- ción (ácida o básica) pero pueden añadirse algunas co- loraciones complementarias al mismo corte, aunque, en la práctica, raramente demuestran detalles adicionales y reducen la nitidez y el contraste de la imagen. Cuan- do se realiza una coloración en tonos grises suaves, es posible superponer un método de inmunofluorescencia. En este caso, a la localización específica del antígeno, se añade una imagen de fondo citológica y topográfica muy superior a las coloraciones nucleares o citoplásmicas de contratinción que suelen utilizarse habitualmente. En el presente trabajo se describe la aplicación de la técnica original de M. Heidenhain para identificar estructuras citológicas en cortes semifinos de tejidos incluidos en glicolmetacrilato. Se trata de aplicar y ajustar el método aprovechando la resolución que per- mite el uso de cortes semifinos y la observación con objetivos de gran aumento. Un tejido adecuado para demostrar su utilidad es la adenohipófisis por presen- tar múltiples tipos celulares, diferentes tipos y tamaños de gránulos de secreción, una fina red de capilares si- nusoides y escaso material extracelular. Procesamiento del tejido. Se han utilizado fragmentos de hipófisis humana, pro- cedentes del archivo de necropsias del Departamento de Anatomia Patologica, Biología Celular e Histología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Cá- diz. La pieza previamente fijada en formol al 10% se incluyó en finas secciones frontales de 2mm de gro- sor en glicolmetacrilato. La glándula no presentaba lesiones macroscópicas. Se realizó la deshidratación progresiva del tejido con acetona de gradación cre- ciente (70%, 80%, 95% y 100%) y a 4ºC, para evitar la retracción del material. La infiltración durante 24h se produce en agitación utilizando una primera solución de glicolmetacrilato catalizada con benzoilperóxido que se cambia por otra nueva durante 12h (9). El blo- que se polimeriza mediante radiación UV (luz negra) en un frasco hermético y en ausencia de oxígeno (que inhibe la polimerización), lo que evita la reacción exotérmica cuando se utiliza un polimerizante. Los cortes se practicaron en un micrótomo motorizado Leica RM2155 con cuchillas de carburo de tungsteno y a un grosor de 1-2 micras. Se recogieron sobre un portaobjetos cubierto de agua ligeramente amoniacal y se secaron sobre una platina caliente. No es necesa- rio utilizar adhesivos. Tinción con Hematoxilina férrica de M. Hei- denhain. Se ha realizado siguiendo el método original en dos tiempos y con una estrategia regresiva(10). Los portas se sumergen a temperatura ambiente en una solución de sulfato férrico amónico 5% recientemente prepa- rada por un mínimo de 6h o hasta el día siguiente (aprox.24h). Se escurren ligeramente y entonces se introducen en una solución de hematoxilina de Re- gaud (hematoxilina 1%, sin oxidar) (4) hasta la maña- na siguiente. En esta solución los cortes se saturan de colorante, deben adquirir un color negro intenso, son opacos, y no se puede observar ningún detalle al mi- croscopio. Para retirar el exceso de colorante, se lavan agitándolos lentamente a través de dos vasos: el pri- mero con alumbre férrico al 5% hasta que se vuelven grises y el segundo al 2,5% para continuar lentamente la diferenciación (extracción del colorante). Conviene observar los cortes al microscopio (sin cubreobjetos y con un objetivo 10x/20x) para controlar la retirada de colorante. Cuando se alcanza un color gris pálido, se pueden lavar en agua abundante, secar en platina caliente y montar un cubreobjetos con DPX u otra re- sina de montaje. Microfotografía y análisis de imagen. Las preparaciones se estudiaron en un microscopio Leica DM2500 en campo claro, ajustando la aper- tura numérica del condensador para la iluminación de Koehler y con los objetivos de inmersión HCX PL Fluotar 63x/NA1,2 y 100x/NA1,3. Las microfoto- grafías digitales se realizaron con una cámara CCD LeicaDFC495 de 8 megapíxeles y fueron adquiridas mediante el software LAS (LeicaApplication Suite), ajustando el histograma y a un tamaño (sin interpo- MATERIAL Y MÉTODOS