Revista nº 814

Martínez-Castillo R, et al. | Endotelio corneal derivado de células madre mesenquimales 283 Actual Med. 2021; 106(814): 280- 290 Técnicas de diferenciación de MSC a endotelio corneal humano El endotelio corneal humano es un tejido que, aunque posee una estructura simple sus características anatomofisiológicas han hecho de él un reto de Ingeniería Tisular. Muchos son los estudios que se han desarrollado en materia de cultivo y expansión de endotelio corneal, tanto en técnicas de aislamiento como diferentes factores de cultivo como el medio de cultivo basal, aditivos y métodos de modulación(27-30). La mayor parte de la evidencia que existe en diferenciación de células madre a endotelio corneal se ha realizado con células madre embrionarias (ES) y células madre pluripotentes inducidas (iPS). Si bien los experimentos realizados difieren entre sí por la pluralidad y falta de uniformidad en los materiales y métodos; sí que tienen una vía común que intenta imitar el desarrollo embrionario del endotelio. Para ello se realiza una primera derivación a células de la cresta neural y de este punto de partida se derivaría a endotelio corneal(31). Del mismo modo, la mayoría de los experimentos publicados sobre regeneración o diferenciación de MSC a tejido corneal se han centrado en las capas del epitelio y estroma corneal y sus patologías asociadas; siendo minoritario el trabajo en materia de endotelio corneal(32). No es hasta 2012, con los hallazgos de Joyce e investigadores, que se demostró la capacidad de las MSC humanas de ser diferenciadas hacia endotelio corneal. En este caso, utilizaron MSC de sangre de cordón umbilical tipo 1 y 4 (UCB1-MSC y UCB4- MSC), las cuales fueron cultivadas en el llamado Lens Epithelial Cell-Conditioned Medium (LECCM), (Medio producido a partir de células epiteliales de cristalino humano cultivadas en Eagle’s Minimal Essential Medium y FBS y su posterior filtrado). Así intentaban mimetizar la posible influencia del cristalino durante el desarrollo embrionario del endotelio corneal. Igualmente, se cultivaron en otros dos medios de cultivo, uno basal o MSC Basal Medium (MSCBM) y Basal Medium to culture Lens Epithelial Cell (LECBM). En primer lugar, se observó la morfología que adquirían en los diferentes medios de cultivo y se realizó un análisis de marcadores “específicos” de endotelio, como las uniones estrechas Zonula Occludens-1 (ZO-1) y un análisis microarray de 250 genes para comparar los cultivos de los dos medios con el medio basal. Por último, realizaron un modelo de daño endotelial ex vivo para ver la capacidad de reparación de estas células mesenquimales. En concreto, se observó que la distribución de marcadores endoteliales se situaba en el citoplasma en el medio de cultivo basal, mientras que los cultivos en medios influenciados por el cristalino, las expresaban en la periferia, como las células endoteliales corneales humanas. Así mismo, la morfología de las MSC se alteró consistentemente en la presencia de LECCM y se obtuvo un perfil genético más próximo al endotelio corneal. Además, en el modelo ex vivo las células presentaron una alta afinidad para adherirse a las zonas de daño endotelial y adquirieron una apariencia de monocapa. Sin embargo, no tenían la morfología propia del endotelio, sino formas elongadas y parecidas a fibroblastos en algunos casos y con superposición(22). Es con Yamashita e investigadores cuando se crea un protocolo centrado en la diferenciación de MSC a endotelio corneal utilizando MSC derivadas del estroma del cordón umbilical. Este protocolo dista totalmente de las técnicas previamente descritas por Joyce. Para ello, utilizan como principal método diferenciador un medio con inhibidor de la isoforma β de la Glycogen Syntethase Kinase (GSK) 3. Comienzan con formación de esferas de MSC colocando MSC a una densidad de 3x10 6 células/placa en placas de cultivo formadoras de esferas 3D usando el medio de DMEM y F12 medium suplementado con factor de crecimiento epidérmico y Dipéptido L-alanina L-glutamina cultivándolas durante 2-4 días para generar esferas. Posteriormente se disocian las esferas en células en solución de disociacioón con Accutasa y después se suspenden en una densidad de 2x10 5 células/cm 2 en platos de 35 mm con reactivo de cultivo de tejidos sin suero que contiene fibronectina, colágeno y albúmina. Estas células se cultivan con el medio inductor de endotelio corneal que está basado en el medio de Eagle Essential Medium suplementado con 0,5 microM de BIO (inhibidor de glicogen kinasa 3β) 10 microM de Y-27632(inhibidor de la ROCK), 1% de insulina, trasnferrina y solución de selenio (ITS-G), triyodotironina 4nM, hidrocortisona 0,5 microgramos /ml , 50 microgramos/ml de acido ascórbico, 1mM piruvato de sodio, 1mM CaCl 2 , MEM aminoácidos y MEM Essential Vitamin Mixture, todo incubado durante una semana cambiando el medio de cultivo cada 2 días. Se observó que el perfil de marcadores celulares de endotelio humano era muy similar al encontrado en las células diferenciadas de MSC; en especial para la ATPasa Na/K, ZO-1 y PITX2 (Marcadores de función endotelial) al mismo tiempo de adquirir una morfología poligonal más próxima al aspecto endotelial. El análisis del proceso de diferenciación reveló que el perfil de marcadores celulares de endotelio humano era muy similar al encontrado en las células diferenciadas de MSC; en especial para la ATPasa Na/K, ZO-1 y PITX2, importantes marcadores de función endotelial, al mismo tiempo adquirieron una morfología poligonal más próxima al aspecto endotelial. De otro lado, el análisis in vitro de la función de bomba de la ATPasa de las nuevas células derivadas, mostró una mayor función en las células derivadas que en las propia estirpe de endotelio corneal humano. Por último, en un modelo de queratopatía bullosa animal in vivo¸ las células endoteliales derivadas de MSC consiguieron mantener el espesor y transparencia corneal(24).