Revista nº 814

Endotelio corneal derivado de células madre mesenquimales | Martínez-Castillo R, et al. 284 Actual Med. 2021; 106(814): 280- 290 Por otra parte, los experimentos más recientes de diferenciación a endotelio se centran en los factores microambientales conocidos y desconocidos que actúan sobre el endotelio. En concreto, el protocolo de Gutermuth y colaboradores se centra en la influencia de la membrana de Descemet y en su microtopografía (DLT). Para ello, aislaron y expandieron las MSC, a partir de biopsias humanas de prepucio y realizaron un denudado de la membrana de Descemet de corneas de conejo explantadas y descelularizadas usando EDTA con agua osmótica purificada. Una vez denudada la membrana de Descemet, 250.000 MSC se cultivaron en la superficie de la membrana de Descemet y a las 24h cambiaron a un medio con Serum Reduced Cultured Medium. Tras analizar la topografía de la membrana de Descemet con un sistema óptico 3D de superficie mediante tecnología láser elaboraron unos moldes/matriz de Polidimetilsiloxane(PDMS) siguiendo la topografía descemética (a grandes rasgos una matriz hexagonal). Esta superficie es previamente tratada con el objetivo de incluir hidrofílicidad y facilitar el crecimiento de MSC en condiciones de cultivo estándar. Una vez llevados a cabo los experimentos utilizando PDM y MSCS se evaluó la morfología celular y se realizó un análisis genético por PCR de los principales genes de endotelio corneal humano además del análisis inmunohistoquímico para demostrar su expresión proteica. Vislumbrando que, además de adquirir la morfología poligonal celular y en monocapa, presentaban mayor cantidad de uniones estrechas, lo que las hace más parecidas al endotelio corneal humano nativo(26). Investigadores del mismo grupo, liderados en este caso por Feiertag y basándose en el protocolo del estudio anterior diferenciaron MSC de la gelatina de Wharton del cordón umbilical humano. Para ello, aislaron las células mesenquimales de la gelatina y prediferenciaron dichas células hacia progenitoras endoteliales incubándolas en medio de Dulbecco Modified Eagle(DMEM) con 0,2 mg/ml de colagenasa NB4 en condiciones estándar durante 24h. El pellet celular resultante se suspendió en Medio de Crecimiento Endotelial 2 (EGM-2) con 20% de FBS y 1% penicilina/estreptomicina 0,1 % CFA y se cultivó a una densidad de 5.000 células/cm 2 . Las células previamente diferenciadas se cultivaron en membranas de colágeno con la microtopografía de membrana de Descemet (DLT) en un área de 1 cm 2 y cultivaron a una densidad de 3.000 células/mm 2 . Las primeras 24h se usó EGM-2 enriquecido con FBS 20% y 1% penicilina. Posteriormente, el medio de cultivo se cambió a Human Endotelial Serum-Free Medium suplementado con 20 ng/ml de bFGF, 10ng/ ml de EGF y 1% penicilina, cambiándose cada 2-3 días. Para la producción de membranas de colágeno con la topografía descemética se utilizó colageno I de cola de rata fundido con la DLT. Seguidamente, se realizó inmunohistoquímica y PCR para detectar las principales proteínas y genes del endotelio corneal humana. Además, en este experimento al igual que en experimentos desarrollados por Yamashita, se evaluó la funcionalidad de las células endoteliales derivadas de MSC midiendo las diferencias de potencial relativo mediante un sistema de dos compartimentos y midiendo la transparencia corneal mediante un modelo ex vivo animal. Por tanto, se desarrolló una monocapa de endotelio corneal humano bien caracterizado y funcional mediante esta diferenciación mediada por mecanismos mecanotransductivos(25)(Tabla 2). Marcadores de diferenciación de MSC diferenciadas hacia endotelio corneal humano Pese al gran desarrollo de la Ingeniería Tisular, a día de hoy no existe un marcador de superficie específico de endotelio corneal humano normofuncionante. Clásicamente, se han identificado como marcadores de “primera generación” la ATPasa Na/K y las uniones estrechas ZO-1, los cuales se expresan en multitud de tipos celulares. La disponibilidad de técnicas de secuenciación genética de nueva generación han permitido descubrir gran cantidad de nuevos genes que se postulan como selectivamente sobreexpresados en el endotelio corneal humano; algunos de estos son CLRN1, MRGPRX3, HTR1D, GRIP1, ZP4, SLC4A11, COL8A2 y CYYR1(27,33). Del mismo modo se ha visto que los marcadores clásicos se expresan altamente en endotelio normomorfo y funcionante (Forma canónica), pero al suspenderse disminuyen drásticamente. Nuevos marcadores como el CD56 o Neural Cell Adhesion Molecule (NCAM), se expresan altamente en el endotelio corneal(34). En los estudios de diferenciación de MSC, en concreto Joyce realizó PCR a las MSC del cordón umbilical derivadas a endotelio de NCAM1, TFAP2B, CDK15, COL8A1, MEIS1, THY1, CDH2 (N-Cadherina) y TJP1(ZO-1). Se cuantificó y comparó con las células endoteliales corneales humanas. Asimismo, se realizó inmunohistoquímica para ZO-1 y para N-cadherina para observar su distribución(22). Por otra parte, Yamashita y colaboradores añadieron al estudio inmunohistoquímica de ZO-1 y CDH2, el de la ATPasa Na/K sibunidad alfa 1(ATP1A1) como un marcador importante de la funcionalidad del endotelio. Realizando además una amplia cantidad de marcadores conocidos hasta la fecha como marcadores de cresta neural humana como ITGA4, SOX9, SOX10, SNAIL, TFAP2 que fueron medidos por RT-PCR; además de PCR de ATP1A1, CDH2, PITX2, COL4A2, SLC4A4, CAR2 y COL8A2(21). Recientes hallazgos de Guthermuth y Feiertag realizan la detección clásica de ZO-1 y de la ATPasa mediante inmunohistoquímica, junto con estudios de PCR de una selección de genes coincidiendo con los estudios de Yamashita de los genes de ATP1A1, COL8A2, PITX2 , ZO-1 y DAPI(25,26).