Revista nº 814

Secuenciación del genoma del SARS-CoV-2 | De Salazar A, et al. 292 Actual Med. 2021; 106(814): 291- 300 Secuenciación genómica: bases metodológicas El genoma constituye el material genético propio de un organismo, el cual viene determinado por las bases nucleotídicas que se unen entre sí y conforman su ADN. El proceso de secuenciación permite conocer el orden preciso de las bases nitrogenadas de una cadena de ADN, determinando su secuencia nucleotídica y el posterior análisis de la misma. En el ámbito de la Microbiología Clínica la caracterización genética del microorganismo en cuestión nos permite identificar al patógeno involucrado en la infección, convirtiéndose en una herramienta más en el diagnóstico microbiológico. En la actualidad, existen diversas técnicas de secuenciación (1-3): • Secuenciación de 1ª Generación (Sanger): Se basa en la síntesis enzimática de la cadena complementaria a aquella que se quiere secuenciar, mediante la adición de dideoxinucleótidos marcados. Estos actúan como terminadores de la cadena interrumpiendo la síntesis y se genera un fragmento de un tamaño determinado condicionado por el nucleótido incorporado; tras ser separados en un gel de electroforesis, y ser leídos posteriormente, permite la reconstrucción de la secuencia molde que queríamos conocer. • Secuenciación de 2º Generación (Next Generation Sequencing o secuenciación de nueva generación, NGS): Esta metodología permite un mayor rendimiento a menor coste, ya que la NGS consiste en generar millones de fragmentos de ADN en un único proceso de secuenciación. Estos fragmentos se asignan a cada una de las muestras analizadas gracias a la preparación previa de una librería que son inmovilizadas sobre una superficie. Existen diferentes tecnologías que nos permiten la realización de NGS, pero todas tienen en común la preparación previa de la librería, inmovilización en una superficie y amplificación de esta, secuenciación y captación de la señal. - Preparación de librería: consiste en fragmentar y marcar, empleando unos adaptadores únicos, a las diferentes muestras de ADN que quieren conocerse. - Fijación a la superficie y amplificación. - Reacción de Secuenciación, existen diferentes estrategias, pero todas ellas nos permiten la detección de las bases incorporadas. La secuenciaciónpor síntesis, empleadapor Ilumina, emplea nucleótidos marcados con fluorocromos, estos se unen por complementariedad de bases, cuando están unidos se excita el fluorocromo y esta señal es captada y traducida a nucleótido. La secuenciación mediante ligación, utilizada por Ion Torrent, emplea una mezcla de sondas marcadas con fluoroforos que se unen mediante ligasas. • Secuenciación de 3º Generación (De Molécula Única): El objetivo de esta tercera generación es la secuenciación de moléculas únicas en tiempo real, sin necesidad de fragmentar el ADN y sin que se requiera la amplificación clonal de las moléculas individuales a secuenciar. Esta tecnología es la que se emplea en los secuenciadores MiniON (4); se basa en la secuenciación de moléculas únicas mediante la detección electrónica a su paso por nanoporos, y que consiste en asociar a este nanoporo una enzima que lo que hace es obligar al ADN a pasar por él, base a base, de tal manera que el campo eléctrico que hay en el mismo se ve distorsionado de una forma concreta por cada nucleótido, con lo cual va leyendo en tiempo real cada una de estas incorporaciones cambiando la magnitud de la corriente de forma especifica para cada base permitiendo así la lectura de la hebra. Aplicaciones de la secuenciación genómica en EEII La incorporación de las técnicas de secuenciación genómica mediante secuenciación de nueva generación ha revolucionado la microbiología clínica, innovando y mejorando el diagnóstico clínico de las enfermedades infecciosas. Además de identificar patógenos con mayor rapidez y precisión que los métodos tradicionales, la secuenciación genómica puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la transmisión de enfermedades, la virulencia y la resistencia a los antimicrobianos (5-7). Hoy en día, la secuenciación de genoma completo en enfermedades infecciosas tiene multitud de aplicaciones en función del campo (8,9): • Aplicaciones en virología: - Identificación de nuevos agentes infecciosos virales. - Pruebas de mutaciones de resistencia a fármacos antivirales y antirretrovirales, en el campo del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis C (VHC), de la hepatitis B (VHB), Citomegalovirus (CMV) o virus de la Influenza, entre otros (10,11). SÍNTESIS DE LA REVISIÓN