Suplemento II · Revista nº 814

61 Actual Med. 2021; 106(814). Supl2: 60- 70 Secuenciación del genoma del SARS-CoV-2 | de Salazar A, et al. S U P L E M E N T O C O V I D - 1 9 fección, convirtiéndose en una herramienta más en el diagnóstico microbiológico. En la actualidad, existen diversas técnicas de secuen- ciación (1-3): • Secuenciación de 1ª Generación (Sanger): Se basa en la síntesis enzimática de la cadena comple- mentaria a aquella que se quiere secuenciar, mediante la adición de dideoxinucleótidos marcados. Estos ac- túan como terminadores de la cadena interrumpiendo la síntesis y se genera un fragmento de un tamaño de- terminado condicionado por el nucleótido incorpora- do; tras ser separados en un gel de electroforesis, y ser leídos posteriormente, permite la reconstrucción de la secuencia molde que queríamos conocer. • Secuenciación de 2º Generación (Masiva): Esta metodología permite un mayor rendimiento a me- nor coste, ya que la secuenciación masiva consiste en generar millones de fragmentos de ADN en un único proceso de secuenciación. Estos fragmentos se asignan a cada una de las muestras analizadas gracias a la pre- paración previa de una librería que son inmovilizadas sobre una superficie. Existen diferentes tecnologías que nos permiten la rea- lización de secuenciación masiva, pero todas tienen en común la preparación previa de la librería, inmoviliza- ción en una superficie y amplificación de esta, secuen- ciación y captación de la señal. ˚ Preparación de librería: consiste en fragmentar y marcar, empleando unos adaptadores únicos, a las diferentes muestras de ADN que quieren conocerse. ˚ Fijación a la superficie y amplificación. ˚ Reacción de Secuenciación, existen diferentes estrategias, pero todas ellas nos permiten la de- tección de las bases incorporadas. La secuencia- ción por síntesis, empleada por Ilumina, emplea nucleótidos marcados con fluorocromos, estos se unen por complementariedad de bases, cuan- do están unidos se excita el fluorocromo y esta señal es captada y traducida a nucleótido. La se- cuenciación mediante ligación, utilizada por Ion Torrent, emplea una mezcla de sondas marcadas con fluoroforos que se unen mediante ligasas. • Secuenciación de 3º Generación (De Molécula Única): El objetivo de esta tercera generación es la secuencia- ción de moléculas únicas en tiempo real, sin necesidad de fragmentar el ADN y sin que se requiera la amplifi- cación clonal de las moléculas individuales a secuenciar. Esta tecnología es la que se emplea en los secuenciado- res MiniON (4); se basa en la secuenciación de molécu- las únicas mediante la detección electrónica a su paso por nanoporos, y que consiste en asociar a este nanopo- ro una enzima que lo que hace es obligar al ADN a pasar por él, base a base, de tal manera que el campo eléctrico que hay en el mismo se ve distorsionado de una forma concreta por cada nucleótido, con lo cual va leyendo en tiempo real cada una de estas incorporaciones cambian- do la magnitud de la corriente de forma especifica para cada base permitiendo así la lectura de la hebra. Aplicaciones de la secuenciación genómica en EEII La incorporación de las técnicas de secuenciación ge- nómica mediante secuenciación de nueva generación ha revolucionado la microbiología clínica, innovando y mejorando el diagnóstico clínico de las enfermedades infecciosas. Además de identificar patógenos con ma- yor rapidez y precisión que los métodos tradicionales, la secuenciación genómica puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la transmisión de enfermedades, la virulencia y la resistencia a los antimicrobianos (5-7). Hoy en día, la secuenciación de genoma completo en enfermedades infecciosas tiene multitud de aplicacio- nes en función del campo (8,9): • Aplicaciones en virología: ˚ Identificación de nuevos agentes infecciosos virales. ˚ Pruebas de mutaciones de resistencia a fárma- cos antivirales y antirretroviales, en el cam- po del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis C (VHC), de la hepatitis B (VHB), Citomegalovirus (CMV) o virus de la Influenza, entre otros (10,11). • Aplicaciones en bacteriología y resistencia antibiótica: ˚ Identificación y caracterización rápida de mi- croorganismos, proporcionando información sobre la relación de las cepas, de dónde provie- nen y cómo han evolucionado. ˚ Identificación de factores clave de virulencia: características específicas que ayudan al mi- croorganismo a causar la infección. ˚ Perfiles de resistencia a los antibióticos: en comparación con los métodos de cultivo tradi- cionales, la secuenciación genómica puede de- terminar a qué antibióticos los microorganis- mos son resistentes mucho más rápidamente y ofrecer un perfil de resistencia completo (12). Esto es especialmente interesante en microor- ganismos de crecimiento lento como Mycobac- terium tuberculosis (13) o microorganismos no cultivables.