Suplemento II · Revista nº 814

63 Actual Med. 2021; 106(814). Supl2: 60- 70 Secuenciación del genoma del SARS-CoV-2 | de Salazar A, et al. S U P L E M E N T O C O V I D - 1 9 Descripción de la metodología para hacer secuenciación de genoma completo de SARS- CoV-2 La metodología de secuenciación del SARS-CoV-2 uti- lizada por los dos centros de referencia de Andalucía, se articula según los objetivos de vigilancia estableci- dos a nivel nacional (búsqueda de patrones de trans- misión, asignación de clados / linajes, confirmación de reinfección, mutaciones fenotípicamente relevan- tes) lo que obliga al empleo de una secuencia de con- senso del genoma completo o casi completo del virus. Aunque este abordaje, no presenta grandes proble- mas técnicos debido al tamaño del virus (aproxi- madamente 30.000 b), si está muy influenciado por la carga viral en la muestra (generalmente exudado nasofaríngeo) medida en base al valor de su umbral de ciclo (Cycle Threshold, CT), de forma que solo las muestras con valores CT menores a 30, son ade- cuadas para el objetivo establecido de secuenciación. El flujo de trabajo básico que se realiza se puede resu- mir de la siguiente manera: 1. Preparación de muestras. Extracción del ARN y su conversión de ARN en ADNc (ADN comple- mentario). 2. Preparación de las librerías. Este proceso implica un flujo de trabajo de secuenciación basado en amplicones mediante el protocolo de código abierto ARTIC (https://artic.network/ncov-2019) . 3. Secuenciación empleando plataformas por síntesis MiSeq/NextSeq (Illumina) o de semiconductores Ion-Torrent (Thermo-Fisher). Una vez concluida la secuenciación, se obtiene un archivo de datos (FASTQ o BAM) para cada uno de los paired-ends , dicho archivo contiene las secuencias ( reads ) y los datos de calidad 4. Análisis bioinformático. Este paso implica el procesamiento del archivo FASTQ o BAM para la obtención de la secuencia del genoma de consenso utilizando un pipeline (nf-core/viralrecon (https:// nf-co.re/viralrecon) . La asignación de clados y las mutaciones anotadas se generan a través de la herramienta Nextclade ( https://clades.nextstrain. org/) . Posteriormente la herramienta de Pangolín (https://cov-lineages.org/) asigna linajes y para aquellos genomas donde no se puede obtener un linaje, se asigna un linaje imputado usando la herramienta interna impuSARS (25). Automatización: una necesidad no cubierta? La NGS está en un proceso de evolución desde una tecnología utilizada con fines de investigación a una que se aplica en el diagnóstico clínico y epidemioló- gico. Esto implica, sobre todo en el caso epidemio- lógico, la necesidad de estudio de un alto número de muestras. En el escenario actual de la pandemia SARS-CoV-2, el número de muestras a secuenciar es muy alto, oscilando entre 400 y 600 semanales. Desde el punto de vista de la secuenciación propia- mente dicha, esto no es un problema, ya que los se- cuenciadores de alto rendimiento utilizados ofre- cen secuenciaciones totalmente automatizadas. Sin embargo, la compleja y engorrosa preparación de las librerías, es un cuello de botella significativo. Sin embargo, los protocolos de preparación de libre- rías son procesos que son susceptibles de ser auto- matizados con desarrollos tecnológicos externos a las plataformas de secuenciación. La construcción de librerías de secuenciación es un proceso de varios pa- sos que podría ser robotizado, sobre todo: la tagmen- tación (fragmentación y etiquetado los amplicones), limpieza tras la tagmentación, la amplificación de los amplicones fragmentados, la agrupación y limpieza de las bibliotecas, por último la cuantificación y nor- malización de bibliotecas. En base a lo anterior, los laboratorios de referencia han implementado una estrategia de automatización para la construcción de las librerías de secuenciación basadas en el empleo de plataformas robotizadas de código abierto OPENTRONS. Esta estrategia, de de- sarrollo propio, ha permitido aumentar la capacidad de secuenciación de forma escalable, logrando capa- cidades que pueden llegar a 1000 muestras/semana sin incrementar la dotación de personal. Además, este desarrollo ha permitido garantizar la normalización y la reproducibilidad en la preparación de las librerías de secuenciación, aspectos muy importantes cuando se trabaja con alto número de muestras. Circuito asistencial e indicaciones de secuenciación en Andalucía Desde la publicación por parte de la Dirección General de Salud Pública y Ordenación Farmacéutica de la Consejería de Salud y Familias de la “Instrucción para la secuenciación de SARS-CoV-2 en Andalucía”, se establecen dos centros de referencia para dar cobertura a la población de nuestra CCAA. Estos centros se ubican en el Servicio de Microbiología del Hospital Universitario Virgen del Rocío, en Sevilla, para dar cobertura a la población de Cádiz, Córdoba, Huelva y Sevilla, y en el Servicio de Microbiología del Hospital Universitario Clínico San Cecilio, para dar cobertura a la población de Almería, Granada, Jaén y Málaga. La instrucción se alinea con las directrices marcadas por el Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar social; en su ultima actualización, de fecha 06/07/2021, se reconocen las siguientes indicaciones: