Revista nº 818

Descelularización de ovario de rata | Zumaquero Pérez RM, et al. 14 Actual Med.2024;109(818):10- 19 tergentes diferentes: 0.1% dodecil sulfato de sodio (SDS) (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) , 0.2% 2-[4-(2,4,4-trimethilpentan-2-il)fenoxi]eta- nol (Tritón-X-100) (Merck/Sigma-Aldrich, EE. UU) y 1% SDC (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU. ) ; junto con ADNasas y ribonucleasas (AR- Nasas) (Merck/Sigma-Aldrich, EE. UU) . Debido a los buenos resultados aparentemente obtenidos al aplicar el P1, se valoró su optimización y de esta for- ma surgen los otros dos protocolos restantes P2 y P3. La diferencia entre estos respecto al P1 reside en dos factores: por un lado, el aumento de la concentración de los detergenetes utilizados (el SDS pasó de 0.1% a un 0.2% y el Tritón-X-100 de 0.6% a un 1%); y por otro lado, el diferente número de ciclos de congela- ción-descongelación (un ciclo para el P2, dos ciclos para el P3) para poder comprobar el impacto real del método físico además del químico (detergentes) y del enzimático (nucleasas). Una vez llevado a cabo cada protocolo, las muestras se almacenaron a 4ºC en formaldehído al 3.7% (p/v) durante 72 horas has- ta su procesamiento. 3. Histología Para el análisis histológico, las muestras se prepa- raron para su inclusión en parafina y finalmente se seccionaron en cortes de 5 μm. Finalmente, se des- parafinaron las secciones durante 20 minutos, se re- hidrataron y se le aplicaron los siguientes protocolos de tinción estándar: hematoxilina y eosina (HE) para visualizar la estructura general (núcleos, citoplas- ma y MEC) , azul alcián (AB) para teñir polisacári- dos ácidos como los glicosaminoglicanos (GAGs) , tricrómico de Masson (MT) para el colágeno y final- mente Verhoeff van Gieson (VVG) para divisar las fibras elásticas, aunque también es capaz de teñir colágeno . Además, se tiñeron secciones con el agen- te intercalante 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para marcar con fluorescencia los restos potenciales de ADN remanente en el tejido. Las imágenes a nivel histológico mostradas en este artículo han sido tomadas principalmente con el escáner Pannoramic Desk II DW (3DHistech, Bu- dapest, Hungría) y con el microscopio Eclipse 90i (Nikon, Tokio, Japón). 4. Cuantificación y análisis estadístico Los componentes de la MEC fueron cuantificados a partir de las muestras teñidas anteriormente me- diante el software ImageJ Fiji versión 1.53f51 (Na- tional Institutes of Health, EE. UU.). Se seleccionó de forma arbitraria la misma sección de cuantifica- ción (28 cm 2 ) respectiva a cada tratamiento de desce- lularización y tinción analizada, analizando un total de tres secciones aleatorias de 28 cm 2 por ovario . Las imágenes fueron obtenidas bajo las mismas con- diciones de intensidad, brillo y contraste de imagen entre tinciones. Todas las gráficas obtenidas en este artículo, así como los análisis estadísticos se rea- lizaron mediante el software Prism 9 (GraphPad, CA, EE. UU.). En lo referido al análisis estadístico, primeramen- te, se calcularon los valores medios de intensidad y la desviación estándar (DE) correspondiente a cada protocolo para normalizar los valores respecto a los resultados del grupo control. Posteriormente se rea- lizó la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk y se confirmó una distribución asimétrica de los datos, por lo que se realizaron pruebas no paramétricas. Se llevó a cabo la comparación de grupos múltiples de Kruskal-Wallis y Dunn para evaluar los niveles de diferencia significativa (las diferencias de p ≤ 0,05 se consideraron significativas y se indican con diferentes superíndices: * y ** ). Finalmente, los datos se presen- tan como la media ± DE. RESULTADOS 1. Análisis histológico, histoquímica y cuan- tificación de los componentes de la MEC De forma macroscópica se puede observar una varia- ción en el tamaño y en la estructura de los ovarios tras la descelularización, mediante la cual, se hicieron más pequeños y adquirieron una estructura menos densa respecto al control (Figura 1. G). En primer lugar, se evaluó la estructura histológica general a través de la tinción HE (Figura 2. A, E, I, N, Q), la cual reveló que los bioandamios generados a partir de los diferentes protocolos de descelulariza- ción aplicados fueron capaces de mantener macros- cópicamente estructuras similares a las presentadas en el patrón histológico típico de la MEC de ovario de rata sin cambiar considerablemente su apariencia morfológica. Se mostró la presencia de materiales tanto basófilos (núcleos celulares) como eosinofílicos (citoplasma celular y MEC) en tejidos nativos y des- celularizados. Esta tinción y especialmente la tinción DAPI (Figura 1. B-F), revelaron presencia visible de núcleos celulares remanentes tras el proceso de des- celularización en todos los protocolos, aunque el P1 ha sido el que ha mostrado una reacción positiva más débil en comparación con el resto de protocolos (Fi- gura 1. A). De forma general, los resultados de la cuantificación histoquímica (Figura 3) muestran una reducción en la intensidad de señal en el porcentaje de área para GAGs, colágeno y fibras elásticas respecto al 100% de intensidad de área de las muestras control. Por un lado; la tinción AB (Figura 2. B, F, J, L, R), usada para teñir GAGs, mostró una reducción de la intensidad