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Ignacio Ruz Caracuel
Capilares, células satélites y fibras musculares regenerativas
INTRODUCCIÓN
Los dos tipos celulares que constituyen el tejido muscular
esquelético, la fibra muscular esquelética y la célula satélite, man-
tienen una estrecha relación con la microvascularización. Por un
lado, el abastecimiento capilar del músculo, que permite el inter-
cambio de gases respiratorios, suministro de nutrientes y meta-
bolitos con las fibras musculares (1) se ve afectado tanto por el
tamaño como por la proporción de tipos de fibras musculares (2).
De otro lado, los capilares mantienen también una estrecha rela-
ción con las células satélites tanto por mantener una correlación
positiva en su número como por su colocalización, ya que en un
músculo normal un 88% de éstas presenta un capilar en su vecin-
dad (3); además, en condiciones de normalidad, esta población
celular se encuentra localizada entre la membrana plasmática y
la lámina basal de la fibra muscular, con lo que se establece un
microambiente bien definido histológicamente conocido como
nicho capilar- célula satélite (4,5).
En la lesión tiene lugar una severa destrucción de la his-
toarquitectura muscular que, sin embargo, es seguida de una
completa regeneración. Se trata de un complejo proceso espacio-
temporal de acontecimientos moleculares, celulares y tisulares
coordinados por los efectos de factores de crecimiento y com-
ponentes de la matriz extracelular, interacciones célula-célula y
célula-matriz (6). En este proceso se distinguen las fases de de-
generación o destrucción, regeneración o reparación y remodela-
ción (7). Básicamente, la fase degenerativa incluye la destrucción
del área afectada y la respuesta inflamatoria; tras ésta, la fase de
regeneración se caracteriza por la activación, proliferación y dife-
renciación de las células satélites, y su fusión en miotubos o fibras
musculares regenerativas. En la fase de remodelación, y simultá-
neamente con el crecimiento y maduración de fibras musculares
regenerativas hacia miofibras adultas, otros elementos tisulares
como la matriz extracelular, red vascular y nervios sufren nota-
bles modificaciones cuyo papel es esencial para garantizar la re-
cuperación morfológica y funcional del músculo (8).
La revascularización del área lesionada se ha relacionado
con las mayores necesidades de oxigenación y nutrientes, nece-
sarias en la intensa fase metabólica de la regeneración (9, 10). En
concreto, se sabe que la fase de remodelación se acompaña de
un aumento de la capilarización, gobernado por los cambios en el
tamaño de las fibras musculares, que se normaliza gradualmente
al final del proceso regenerativo (11,12). De acuerdo a la etapa
de maduración de las fibras musculares regenerativas, las células
satélites que se asocian a ellas también varían en número, carac-
terísticas morfológicas y morfométricas (13).
Si bien se ha señalado que la miogénesis y la angiogénesis
son acontecimientos coordinados durante la regeneración (14),
no queda claro si las modificaciones cuantitativas que ocurren en
la red capilar, fibras musculares y células satélites pueden afectar
también a sus relaciones topográficas. En nuestra opinión este
aspecto es importante ya que determinaría el comportamiento
funcional de estos elementos en la coordinación de la angiogéne-
sis y miogénesis regenerativa.
En este sentido, el presente estudio examina, en tres etapas
evolutivas de la fase de remodelación, las modificaciones en las
relaciones topográficas de los capilares con las fibras musculares
regenerativas y con las células satélites que las acompañan. Por
lo que respecta a la fibra muscular en regeneración, analizamos
las distancias de difusión, un parámetro de gran importancia para
determinar la oxigenación de un tejido (15, 16, 17). Por otro lado,
aunque se ha referido que probablemente la razón de la posición
yuxtavascular de las células satélites durante la regeneración esté
en relación con la influencia reguladora mediante la secreción de
factores solubles que interaccionan entre ambos elementos (5),
no existen datos estructurales de la relación entre capilares y cé-
lulas satélites durante este proceso.
MATERIAL Y MÉTODOS
Animales:
Ratas Wistar adultas de un peso aproximado de 210 g reci-
bieron, bajo anestesia, una inyección intramuscular de mepiva-
caina al 2% en los músculos tibial anterior para inducir la dege-
neración y posterior regeneración de las fibras musculares. Los
animales fueron sacrificados por decapitación bajo anestesia (75
mg/Kg de ketamina y 0.5 mg/Kg de medetomidina), en grupos
de seis ratas cada uno, a los 5, 7 y 20 días tras la lesión; seis ra-
tas normales fueron empleadas como controles. Todos se man-
tuvieron en condiciones controladas de temperatura (20-23°C),
iluminación (ciclos controlados de 12 h luz-12 h de oscuridad) y
con suministro de comida (Purina, Barcelona, España) y agua ad
libitum. El protocolo de cuidado y condiciones experimentales de
los animales fueron aprobados por el Comité de Bioética de la
Universidad de Córdoba (España).
Procesamiento de muestras y técnicas de estudio:
Tras el sacrificio los músculos tibial anterior fueron disec-
cionados y del vientre muscular se tomaron muestras que fueron
troceadas en pequeños fragmentos, fijadas en glutaraldehido al
2.5% durante 48 horas a 4°C y refijadas en tetróxido de osmio al
1% durante 1 hora a 4°C. Posterioremente fueron deshidratadas
en acetonas de graduación creciente e incluidas en araldita. En
un ultramicrotomo se obtuvieron cortes semifinos que fueron te-
ñidos con azul de toluidina para su análisis en microscopía de luz
y cortes ultrafinos, contrastados con citrato de plomo y acetato
de uranilo, para su observación en un microscopio electrónico de
transmisión Philips CM10 (Servicio Centralizado de Apoyo a la In-
vestigación SCAI. UCO).
Estudio cuantitativo:
Empleando cortes semifinos teñidos con azul de toluidina,
seleccionamos aquellos bloques (10 por cada período regenera-
tivo y grupo control) que contenían áreas homogéneas de fibras
musculares cortadas transversalmente. Puesto que con esta tin-
ción fue evidente la distinción de tipos de fibras en los músculos
normales y a los 20 días postlesión (pero no a los 5 y 7) el estudio
cuantitativo se realizó teniendo en cuenta la existencia de fibras
tipo I y II. Las imágenes fueron capturadas y digitalizadas, a unos
aumentos de x400), con una cámara Sony Exwaved HAD montada
en un microsocopio Nikon Eclipse E1000. El estudio cuantitativo-
morfométrico se realizó empleando el programa de análisis de
imagen Imago-Pro Plus (Media Cybernetics, Version 6, 2006).
Sobre los cortes seleccionados analizamos la densidad de
fibras (DF:número de fibras/área), la densidad capilar (DC: núme-
ro de capilares/área); a partir de estos parámetros fue calculada
la proporción capilar/fibra (índice C/F). En las mismas áreas fue
medida el área ocupada por intersticio que fue expresada como
porcentaje de la región analizada. Estas mediciones se realizaron
en dos áreas de cada sección semifina bloque, cubriendo en con-
junto un área total de 94500 µm
2
.
Distancias de difusión entre capilares y fibras musculares:
A unos aumentos de x1000 se estimó la distancia de difu-
sión utilizando un esquema de círculos concéntricos superpues-
to sobre la fibra muscular. Desde 20 puntos tomados al azar del
interior de cada fibra se midió la distancia al capilar más cercano
a cada uno de ellos (18, 19). Este procedimiento se repitió para
un total de 20 fibras, tomadas al azar, de cada tiempo postlesión
(5, 7 y 20 días) y fibras normales. Los resultados obtenidos se
presentaron como una distribución de frecuencias acumulativas
de forma individualizada para cada estadío regenerativo y fibras
musculares normales. De los valores obtenidos fueron calculados
el percentil 50 (R50) y el percentil 95 (R95) como distancias de
difusión media y máxima respectivamente.
Distancias de difusión entre capilares y células satélites:
En microscopía electrónica de transmisión fueron cuantifi-
cadas las células satélites que presentaban un capilar en su vecin-
dad (3), fotografiadas a unos aumentos de 6000x y transferidas a
un ordenador. Sobre las micrografías electrónicas se estimó la dis-
tancia de difusión desde 20 puntos de la célula satélite, tomados
al azar y siguiendo el esquema de círculos concéntricos, al capilar
más cercano a ella. Este procedimiento se repitió para un total
de 20 células satélites en cada tiempo postlesión y de músculos
controles. Las distancias fueron agrupadas en tres tramos (<5µm,
5-10µm, >10µm) según lo descrito por Christov et al (3).