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Mª Ángeles Muñoz Miguelsanz
Preservación hipotérmica del intestino delgado
Soluciones de preservación empleadas
Las soluciones de preservación empleadas han sido el
suero Fisiológico Mein (Fresenius Kabi, Barcelona, España), el
Apiroserum Ringer Lactato (Fresenius Kabi, Barcelona, España)
y la solución Celsior (Genzyme Corporation, Cambridge, Mass,
EEUU). En la Tabla 1 se observa la composición de las soluciones
previamente mencionadas.
Tabla 1: Composición de las soluciones de preservación.
Grupos experimentales
Los ratones CD1 fueron clasificados en 4 grupos
experimentales. Todos los grupos fueron perfundidos
vascularmente con una solución de preservación y a continuación
se procedió a la infusión intraluminal de la misma, a excepción del
grupo control, de la siguiente forma:
Grupo 1: no vascular/ no intraluminal
Grupo 2: solución salina (SS)
Grupo 3: solución de Ringer-Lactato (RL)
Grupo 4: solución de Celsior (Celsior)
Microscopía electrónica de barrido
Tras 14 horas de preservación hipotérmica con las distintas
soluciones de preservación, se procedió al procesamiento de las
muestras para microscopía electrónica de barrido (MEB)(20).
Para ello, se aislaron pequeños segmentos de íleon (0.4 x 0.4 nm)
procediendo a su fijación inmediata con 2.5 % de glutaraldehído
grado ME (Sigma-Aldrich, Barcelona, España) en tampón fosfato
0.1M, pH 7.2 a 4ºC durante 24 horas. Tras la fijación, se procedió
al lavado de las muestras (3 veces, 10 min) con tampón fosfato
0.1M, pH 7.2. A continuación, las muestras fueron deshidratadas
con concentraciones de alcohol etílico crecientes y desecadas
mediante la técnica del punto crítico utilizando CO
2
(Balzers CPD30,
Bal-Tec AG, Liechtenstein). Posteriormente, las muestras fueron
montadas sobre portamuestras de Al, utilizando planchas de
grafito autoadhesivas de 12 mm de diámetro (EMS, Hatfield, USA).
Finalmente, se procedió a la metalización de las muestras mediante
Au/Pd utilizando un metalizador Quorum SC7620 (Quorum
Technologies Ltd, Kent, UK). Las muestras fueron observadas en
modo convencional utilizando un microscopio electrónico de
barrido Phillips XL 30 (FEI, Eindhoven, Holanda) a 15 kV.
RESULTADOS
En la figura 2 se muestra la superficie de la mucosa
intestinal del íleon distal de ratones CD1 controles observados
mediante MEB. La superficie muestra una imagen ortotípica
caracterizada por un patrón vellositario digitiforme con
vellosidades intactas en sus vértices, ausencia de exudados
epiteliales y patrón microvellositario conservado. En las figuras
3, 4 y 5 se muestra el efecto de las distintas soluciones de
preservación sobre la superficie intestinal. Tras 14 horas de
almacenamiento hipotérmico a 4º C, el grupo 2 se caracterizó
por mostrar un patrón vellositario similar al grupo control (Figura
3A). No obstante, es posible observar un aumento de la pérdida
de células en el vértice de las vellosidades intestinales (Figura
3B). Las células epiteliales se caracterizan por mostrar un patrón
microvellositario normal (Figura 3C).
Figura 2. Microscopia electrónica de barrido de íleon de ratón
control. (A) Imagen ortotípica del patrón digitiforme vellositario.
(B) Enterocitos bien delimitados conformando el epitelio
vellositario con ausencia de exudados epiteliales y patrón
microvellositario conservado.
El grupo 3 se caracterizó por mostrar un patrón vellositario
conservado de manera no uniforme con mayor definición
de los enterocitos y apreciación de las criptas de Lieberkühn
(Figura 4A) hallando algunos grupos de vellosidades con pérdida
de células epiteliales, sobre todo en la región apical (Figura
4B) con el eje conjuntivo-vascular preservado y apareciendo
hendiduras subepiteliales de moderada amplitud (Figura 4C); los
enterocitos mostraban un patrón microvellositario compacto y
uniforme (Figura 4D). El grupo 4 presenta un patrón vellositario
desestructurado con extensas zonas de pérdida casi total del
eje longitudinal (tanto eje conectivo como epitelial) (Figura 5A).
SOLUCION
SALINA
0.9%
RINGER
LACTATO
CELSIOR
K
+
(mmol/l)
-
4
15
Na
+
(mmol/l)
154
130
100
Mg
2+
(mmol/l)
-
-
13
Ca
2+
(mmol/l)
-
0.75 0.25
Cl
-
(mmol/l)
154
109
-
HCO
3
(mmol/l)
-
-
-
Glucosa
-
-
-
Manitol
-
-
60
Osmolaridad
(mOsm/kg)
308
272
360
pH (25º)
5.5
6
7.3