INTRODUCCIÓN

La implementación de la espectrometría de masas MS MALDITOF® Autoflex III (Bruker Daltonics) (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) en el diagnóstico etiológico en el laboratorio de microbiología, ha permitido la identificación de nuevos microorganismos de difícil diagnóstico a través de métodos tradicionales. Este es el caso de Aerococcus urinae (1) , microorganismo que se ha relacionado con bacteriemia, endocarditis, infección urinaria, pielonefritis, meningitis, infección de piel y partes blandas, espondilodiscitis, linfadenitis, artritis y peritonitis. Actualmente este género engloba a 8 especies diferentes; Aerococcus viridans, A. urinaeequi, A. christensenii, A. urinaehominis, A. sanguinicola, A. suis, A. vaginalis y A. urinae, siendo esta la principal especie causante de ITU.

La identificación clásica, mediante sistemas convencionales basados en características bioquímicas, es a menudo errónea (2,3), por lo que probablemente este microorganismo, causante de diferentes infecciones en el ser humano, se pueda estar infradiagnosticando.

Por todo ello, el objetivo de este estudio se centro en demostrar la implicación clínica real de A.urinae como agente causante de infección urinaria a través de la espectrometría de masas MALDI-TOF, la técnica permite la detección del tiempo de vuelo mediante un detector de iones TOF (Time-Of-Flight) para las diferentes biomoléculas del microorganismo. La ionización producida por la irradiación de un laser pulsado sobre estas biomoléculas permite medir el tiempo de vuelo generándose un espectro representado como la intensidad de los iones frente a la relación masa/carga (m/z) que es comparado con una amplia librería de espectros de referencia generados para otros microorganismos. Se obtiene un score de intenfificación de 0 a 3 en función de la fiabilidad en la identificación obtenida ( identificacion fiable a nivel de género y especie score ≥ 2 , identificación fiable únicamente a nivel de género score de 1.7 a 1.9, identificación no fiable score <1.7 ). Asimismo, la identificación fue comparada con otras técnicas de diagnóstico clásico que utilizan pruebas bioquímicas, como Api 20 Strep® (Biomerieux) o WIDER®(Soria Melguizo). La lectura automatizada mediante el sistema WIDER utiliza para la identificación de microorganismos e interpretación de la sensibilidad antibiótica, un analizador de imágenes por visión artificial. Los paneles para lectura automática incorporan diferentes pruebas bioquímicas en diferentes pocillos y distintas concentraciones de diferentes antibióticos para el estudio de la concentración mínima inhibitoria (CMI). La identificación utiliza pruebas convencionales y cromogénicas modificadas y se basa en la detección de cambios de PH, utilización de sustratos y crecimiento en presencia de agentes antimicrobianos después de 16-48 horas de incubación a 35ºC.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se analizaron de forma prospectiva, todas las orinas recibidas en el Servicio de Microbiología del Hospital Clínico Universitario San Cecilio de Granada (España), desde Mayo a Septiembre de 2014. En este periodo se analizaron 9261 muestras de orina, a las cuales se le solicitaba la realización de urocultivo. Inicialmente se realizó un screening de orina basado en citrometría de flujo mediante el sistema UF1000i, para el recuento de leucocitos, bacterias y levaduras en orina. Todas las muestras que resultaron positivas para cualquiera de estos parámetros fueron inoculadas en agar sangre (AS) y agar MacConkey y se incubaron a 37º C durante 18-24 horas, para posterior recuento.

Todos los aislamientos con un recuento mayor a 100.000 UFC/mL, en las que se aislaba una colonia alfa-hemolítica en cultivo puro, se sometieron a identificación directa de la colonia, por espectrometría de masas MALDI-TOF, añadiéndose 1µl de matriz (ácido-alfa-ciano-4-hidroxicinámico) para la realización de una lectura automatizada en el sistema MALDI-TOF, el cual posee un software (FlexAnalysis Biotyper 3.3), para el análisis de los diferentes espectros (perfiles proteínicos con rango de masas de 100-1000 Da). Asimismo, los aislados fueron contrastados con secuenciación ARNr 16S. Además, todas las muestras en las que fue aislado A.urinae, fueron identificadas de forma paralela a nivel de especie mediante WIDER y Api 20 Strep®.

El perfil de sensibilidad a antimicrobianos se realizó mediante E-Test en Müeller-Hinton (MH), utilizando un inóculo de 0.5 McF.

A todos los pacientes diagnosticados clínicamente con infección urinaria por A. urinae se les registraron los siguientes datos clínicos: edad, sexo, antecedentes generales, presencia de patología urinaria subyacente, síndrome miccional, leucocitos y nitritos en orina, tratamiento antibiótico y evolución clínica.

RESULTADOS

De las 9261 muestras de orina analizadas, 1513 muestras resultaron tener un recuento mayor a 100.000 UFC/mL. A. urinae fue aislado en 3 casos. La colonia fue identificada en todos los casos mediante Api 20 Strep® como Aerococcus viridans tipo 2, mientras que mediante el sistema Wider® se identificó como Streptococcus anginosus. La identificación mediante espectrometría de masas MALDI-TOF como A.urinae fue contrastada con secuenciación ARNr 16S en todos los casos.

Los datos clínicos quedan reflejados en la tabla 1. Todos los pacientes mostraron una evolución clínica favorable, al tratamiento.

Tabla 1. Resumen de  los 3 casos con urocultivo con recuento positivo para Aerococcus urinae.

DISCUSIÓN

La implicación de A.urinae como agente causante de ITUs (2,4,5,6,7), está ampliamente referida en la literatura. Sin embargo, se ha asociado a una baja prevalencia, y los estudios muestran que A.urinae presenta una tasa de aislamiento de todas las muestras enviadas al laboratorio que varía entre un 0.25 – 0.8 % 8, hecho que con mucha probabilidad se deba a un infradiagnóstico microbiológico, ya que la utilización de técnicas clásicas basadas en características bioquímicas no son siempre concluyentes (2,3).

Resulta cuanto menos llamativa, la relación etiológica de A. urinae reflejada en la bibliografia con pacientes en la tercera edad, que a su vez, presentan con gran frecuencia cuadros hipertensivos con una patología urinaria subyacente (2,4,5,6,9,10). En nuestro estudio todos nuestros pacientes eran pacientes en la tercera edad y presentaban una patología urinaria subyacente. Recientemente ha sido demostrada la implicación de A. urinae en la formación de biopelículas en sangre (11), hecho que pone de manifiesto en estos pacientes un posible riesgo de endocarditis infecciosa.

Aunque actualmente no existe un comité que establezca puntos de corte de sensibilidad antibiótica para A. urinae, ésta debe inferirse utilizando puntos de corte establecidos para estreptotococos del grupo viridans (12). A. urinae se considera con alta frecuencia sensible a penicilina en concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) inferiores a 0.25 mg/L y todos nuestros aislados tuvieron una CMI inferior a 0.16 mg/L. Asimismo, como ocurre en el caso de los estreptococos del grupo viridans, el uso de un aminoglucósido en monoterapia, para tratar a especies de este género, es poco efectivo. Sin embargo, el uso combinado con un β-lactámico, en cepas con bajos niveles de resistencia a gentamicina (CMI<128 mg/L) aumenta su actividad, debido a la acción sinérgica de ambos (13). En todos nuestros aislados existió una resistencia de bajo nivel a gentamicina (1-3 mg/L). Otros antibióticos como la fosfomicina, utilizada con frecuencia en las infecciones del tracto urinario, demostraron ser efectivos. Nuestros aislados tuvieron un bajo nivel de resistencia a fosfomicina (CMI entre 3-8 mg/L), estando descrita en la bibliografía una CMI90 de todos los aislados de A.urinae en torno a 32 mg/L, utilizando como punto de corte el establecido para enterobacterias (debido a la inexistencia de puntos de corte para estreptococos del grupo viridans)(14). En consonancia con otros estudios publicados, A.urinae presentó una alta resistencia a fluoroquinolonas, todos nuestros aislados tuvieron una CMI por encima de 1 ( 1-3 mg/L), siendo sensible con CMIs inferiores a 0.5 mg/L12. Un tratamiento antibiótico alternativo en pacientes alérgicos a penicilinas o a fluoroquinolonas, como trimetropim-sulfametoxazol, recomendado por la Sociedad de Enfermedades Infecciosas de Estados Unidos y la Sociedad Europea de Microbiología y Enfermedades Infecciosas para cistitis o pielonefritis (15), podría desencadenar con alta probabilidad un fracaso terapéutico. A. urinae presenta con gran frecuencia resistencia a éste antibiótico. A. urinae presentó una CMI por encima del límite de detección de resistencia mediante E-Test (CMI>32 mg/L) en todos nuestros aislados. Por consiguiente, la amoxicilina o fosfomicina como terapia alternativa (12) serían antibióticos adecuados en el tratamiento de las infecciones urinarias por A.urinae.

En nuestro estudio destacamos la mala identificación bioquímica a nivel de especie realizada por el sistema API 20 Strep®, mediante el cual todos los aislamientos confirmados como A. urinae se clasificaron como Aerococcus viridans tipo 2, o los sistemas automatizados tipo Wider® que lo identifican como Streptococcus anginosus. Ninguno de estos sistemas contemplaba codificación numérica para la identificación de A. urinae. Debido a ello, recomendamos que, tras una sospecha de aislamiento se realice una tinción de Gram, pues a diferencia de otros Estreptococos del grupo viridans, A. urinae conforma agregados en tétradas. Para una identificación final más exhaustiva a nivel de especie existen pruebas bioquímicas diferenciales de A. urinae descritas en la bibliografía, A. urinae es LAP positivo y PYR negativo, siendo estas dos pruebas bioquímicas claves en el diagnóstico diferencial con otros Estreptococos alfa-hemoliticos como A. viridans tipo 2 o S. anginosus.

La baja prevalencia que se ha descrito para este microorganismo puede también deberse a que, a su vez A. urinae guarda una gran similitud en el diagnóstico a primera vista con otras colonias consideradas microbiota habitual del tracto genitourinario, por lo que subrayamos que su identificación podría estar siendo subestimada en la mayor parte de los laboratorios de microbiología clínica.

Existen técnicas de identificación de microorganismos cada vez más potentes, como la espectrometría de masas MALDI-TOF, avaladas en la bibliografía8 por ser herramientas eficaces en la identificación rápida si se trata de microorganismos de difícil diagnóstico. Actualmente, la espectrometría de masas MALDI-TOF esta teniendo cada vez una mayor presencia en el diagnóstico microbiológico de rutina en hospitales de referencia, debido a su gran rapidez, sensibilidad y especificidad. En nuestro estudio todos nuestros aislados fueron filiados de manera correcta mediante ésta técnica, con un score de identificación > de 2 y confirmados como A.urinae mediante PCR.

CONCLUSIONES

En resumen, presentamos la primera serie descrita de 3 casos clínicos de infección urinaria por A.urinae en España, presentando una prevalencia del 0,001%. Creemos que pese a su baja tasa de aislamiento, se deben extremar las precauciones para no subestimar la presencia de este microorganismo como agente causante de ITU, y recomendamos la tecnología MALDI-TOF como la mejor herramienta para su identificación.

REFERENCIAS

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INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO

Autor para la correspondencia: Santiago Pérez Parra. Microbiología Clínica Hospital Universitario San Cecilio (Granada). Teléfono: 958023879 / Fax: 958023551. E-mail: santperez85@gmail.com