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Antonio Ruiz García
Control microbiológico en terapias avanzadas
y sin producto celular a ensayar). Se han realizado 4 réplicas de los
frascos inoculados sólo con el producto a ensayar (especificidad) o
sin inocular (esterilidad).
Como comparador de referencia se han realizado dos réplicas
de 30 UFC y 5 de 15 y 6 UFC respectivamente siguiendo el méto-
do de inoculación directa en medio de cultivo descrito en la Eu Ph
2.6.1 para el ensayo de esterilidad. Se han utilizado 5 réplicas con un
inóculo de 15 y 6 UFC para minimizar la variabilidad de Poisson que
establece para una probabilidad de resultado negativo debido al azar
(siembra demenos de 1 UFC, del orden 1/ e-6) de aproximadamente
0.25.
Se han analizado los tiempos de detección de los microorga-
nismos en el caso del inóculo menor (6 UFC) considerado como peor
caso, comparando los datos obtenidos en las botellas con y sin me-
dicamento.
RESULTADOS
Comprobación de esterilidad de los medios de cultivo micro-
biológicos.
Se ha verificado la esterilidad de los medios de cultivo micro-
biológicos utilizados en este estudio de validación (botellas de hemo-
cultivo aerobios y anaerobios, tubos de tioglicolato y TSB), incuban-
do 4 frascos o tubos de cada medio y comprobando que no hay de-
tección ni crecimiento microbiano durante el periodo de incubación.
En ninguna de las botellas de hemocultivo incubados se detec-
tó crecimiento microbiano tras siete días de incubación a 35-37ºC.
En ninguno de los tubos de tioglicolato y TSB incubados se de-
tectó crecimiento microbiano tras 14 días de incubación a 32,5ºC ó
22,5ºC respectivamente.
Especificidad de los medios de cultivo microbiológicos
Se ha realizado por cuadriplicado la prueba de
especificidad
(ausencia de falsos positivos) inoculando 4 botellas de cada uno de
los medios (frascos de hemocultivo aerobios y anaerobios, tioglicola-
to y TSB) con el producto a ensayar (medicamento: CMMTAd en lac-
tato de Ringer con albúmina) y comprobando que no hay detección
ni crecimiento microbiano durante el periodo de incubación.
En ninguno de los frascos de inoculados con el producto a en-
sayar se detectó crecimiento microbiano tras siete días de incuba-
ción a 35-37ºC.
En ninguno de los tubos de tioglicolato y TSB inoculados con el
producto a ensayar se detectó crecimiento microbiano tras 14 días
de incubación a 32,5ºC ó 22,5ºC respectivamente.
Límite de detección y reproducibilidad de la técnica
Se ha calculado el
límite de detección
añadiendo a los
medios
de cultivo
(frascos de hemocultivo, tioglicolato y/o TSB) un inóculo
de microorganismos viables conteniendo 30, 15 y 6 UFC respectiva-
mente de cada una de las cepas a estudiar
(Aspergillus niger
ATCC
16404,
Bacillus subtilis
ATCC 6633,
Candida albicans
ATCC 10231,
Clostridium sporogenes
ATCC 1437,
Pseudomonas aeruginosa
ATCC
9027, Staphylococcus aureus ATCC 6538).
Se han inoculado cuatro botellas de hemocultivo con 30 UFC,
cinco con 15 UFC y cinco con 6 UFC (aerobio o anaerobio según la
cepa inoculada) y 2 tubos de medios de cultivo del ensayo clásico de
esterilidad (TSB o Tioglicolato según la cepa inoculada) con 30 UFC,
dos con 15 UFC y cinco con 6 UFC. Se han comprobado los inóculos
de cada una de las cepas sembrando una Bioball
®
en placa de agar
sangre y haciendo recuento visual de las UFC.
Así mismo, se ha realizado el
límite de detección en presencia
del material a ensayar
, en nuestro caso con el medicamento (sus-
pensión de CMMTAd en lactato de Ringer con albúmina). La técnica
es la misma que la anteriormente descrita con la única diferencia de
que se han inoculado los frascos y tubos con los microorganismos en
presencia del medicamento.
(*Ver tabla 1 en página 27)
Tiempos de detección
Para cada cepa en el caso del inóculo inferior (6UFC) en el siste-
ma automatizado se han determinado los tiempos de detección en
presencia o no de la suspensión celular.
(*Ver tabla 2 y 3 y fig. 2 en página 28)
DISCUSIÓN
El uso de un sistema automatizado de detección de contamina-
ción microbiana es de una gran utilidad en el control microbiológico
de productos celulares, por lo que resulta de gran aplicación en el
campo de las Terapias Avanzadas. Actualmente se utiliza en el con-
trol microbiológico de médula ósea, sangre de cordón y otros tejidos
(8), en el control de condrocitos para terapia celular (9) y otros medi-
camentos inyectables (6).
Una de las características de los medicamentos de terapias
avanzadas es su corta vida, por lo que es necesario disponer de un
sistema que aporte resultados en el menor tiempo posible.
En nuestro estudio hemos demostrado que el sistema es ade-
cuado para el control microbiológico de unmedicamento de terapias
avanzadas elaborado a partir de células madre mesenquimales de
tejido adiposo.
A la vista de los resultados del valor P, no existen diferencias
significativas entre el tiempo de detección de los microorganismos
en presencia del producto a ensayar o en ausencia del mismo, por lo
que podemos concluir que el medicamento no produce interferen-
cias en el ensayo.
Comparando éstemétodo automatizado con el método clásico
de esterilidad de la Farmacopea Europea, se observa que son equiva-
lentes en cuanto a la obtención de resultados, si bien el sistema auto-
matizado proporciona resultados con mayor rapidez y no es necesa-
rio esperar 14 días como en el método clásico para considerar que un
producto es estéril ya que con 7 días es suficiente. Otra ventaja del
sistema automatizado es la temperatura única de incubación para
bacterias, hongos y levaduras a 35-37 ºC, mientras que el método
clásico requiere temperaturas de 30-35 ºC para bacterias y de 20-25
ºC para hongos y levaduras. Esto permite obtener resultados en me-
nor tiempo en consonancia con otros estudios (5, 7, 10)
También es un método más fiable ya que no depende de la
pericia del ojo humano para detectar la turbidez en los medios, si no
que lo detecta el equipo automáticamente por un cambio de color
en un reactivo colorimétrico que se encuentra en la parte inferior
de la botella y que es detectado por una célula fotoeléctrica, por lo
tanto el equipo es susceptible de ser calibrado y cualificado, aspecto
no realizable en un método manual.
Otra ventaja es que el equipo emite una alerta visual en la pan-
talla de control que avisa en caso de que exista una botella positiva,
incluso alerta previamente de que hay botellas que son susceptibles
o próximas a ser positivas, por lo que en caso de que sea necesario
tomar acciones correctivas, éstas puedan ser más inmediatas.
Como conclusión, el sistema de detección por hemocultivo
BacT / ALERT es un método válido para el control microbiológico de
las células mesenquimales para terapia celular, según la Farmaco-
pea Europea (EU.PH), 2.6.27. Control microbiológico de productos
celulares. Los productos celulares a ensayar no alteran el límite de
detección de los sistema de cultivo automatizados BacT/Alert para
las seis cepas ensayadas, que es ≤ 6 UFC”. La técnica es reproducible
ya que se obtienen los mismos resultados en las réplicas realizadas
del ensayo.