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Antonio Ruiz García
Control microbiológico en terapias avanzadas
INTRODUCCIÓN
El control de calidad para demostrar que un producto está
libre de agentes microbianos adventicios es un aspecto clave de
control de procesos y evaluación de la calidad de todas las prepa-
raciones medicinales celulares, tanto para terapia celular como
para ingeniería tisular.
El método clásico para la detección de agentes microbianos
es el Test de Esterilidad de la Farmacopea Europea (2), que para
productos celulares se lleva a cabo mediante inoculación directa
en medios de cultivo líquidos (Thioglicolato y TSB) y que tiene un
periodo de incubación de 14 días a 32 ± 2ºC en el caso del Thiogli-
colato y a 22 ± 2ºC en el caso del TSB. Uno de los inconvenientes
es por tanto el tiempo de incubación, que el caso de productos
celulares en muchos casos es inviable, y otra es que la detección
se hace de forma visual, con lo que está sujeta a la subjetividad
del individuo.
Existen nuevos métodos disponibles que aportan resultados
más rápidamente con la posibilidad de tomar antes acciones co-
rrectivas en caso necesario.
Los sistemas de detección por hemocultivo han demostrado
ser métodos robustos, fiables y además están automatizados, por
lo que ahora se incorporan a la Farmacopea Europea para el con-
trol microbiológico de productos celulares.
Sin embargo, estos métodos tienen que ser validados en la
presencia del tipo de preparación para ser examinado con respec-
to a la especificidad (ausencia de falsos positivos), la sensibilidad
(límite de detección) y la reproducibilidad. Se debe comprobar
por tanto que el método es adecuado para controlar la presencia
de agentes microbianos en el producto, y que éste no interfiere
en el crecimiento de microorganismos.
Por tanto el objetivo de este estudio es demostrar que el
método de detección por hemocultivo Bact/Alert (3) es válido
para el control microbiológico del producto celular “Células me-
senquimales troncales de tejido adiposo (CMTTAd)”
MATERIAL Y MÉTODOS
Los materiales y equipos utilizados son:
Medios de cultivo: BacT/ALERT® botellas de hemocultivo
para industria aerobios (iFA) y anaerobios (iFN). Tubos de Thio-
glicolato y TSB.
Sistema de deteccion: BacT/ALERT 3D60
®
, tiempo de incu-
bación 7 días a 35-37 ºC.
Producto celular: Suspensión de células mesenquimales
obtenidas de tejido adiposo a 2.000.000 células /ml en Lactacto
de Ringer y Albumina al 1%.
Cepas de microorganismos: Staphylococcus aureus. Baci-
llus subtilis. Pseudomonas aeruginosa. Candida albicans. Asper-
gillus niger y Clostridium sporogenes.
Los inóculos se preparan a partir del preparado comercial
BioBall
®
(4) soluble en agua que contienen 30 ± 2 microorganis-
mos/bola.
Para verificar y documentar la capacidad de los medios de
cultivo para detectar microorganismos aerobios, anaerobios,
levaduras y hongos filamentosos en presencia del material a
ensayar, se ha llevado a cabo la validación del control microbio-
lógico, según indicaciones de European Pharmacopoeia 2.6.27.
“Microbiological control of cellular products”.
Los frascos de hemocultivos aerobios y anaerobios contie-
nen un medio líquido y carbón activo, capaces de neutralizar
de antibióticos y otras sustancias inhibidoras, que permiten el
crecimiento de microorganismos. El crecimiento microbiano se
detecta mediante un sistema incubador/lector automático.
La validación se realiza respecto a esterilidad de los medios
(frascos sin inocular) especificidad (ausencia de falsos positivos), sen-
sibilidad (límite de detección), idoneidad del ensayo con las muestras
y reproducibilidad. Adicionalmente, debido a que el sistema automa-
tizado permite determinar el tiempo de detección de los microor-
ganismos, se ha calculado la media de los tiempos de detección en
presencia o no de del medicamento.
Para verificar y documentar la
esterilidad de los medios y la
especificidad
de los medios de cultivo utilizados en el ensayo de con-
trol microbiológico de productos celulares, se ha comprobado que
los frascos no inoculados e inoculados con el producto celular sinmi-
croorganismos no dan resultados falsamente positivos.
Para verificar y documentar la
sensibilidad
o límite de detec-
ción, es decir, la capacidad de los medios de cultivo para detectar
pequeñas cargas de microorganismos aerobios, anaerobios, leva-
duras y hongos filamentosos, así como comprobar esta capacidad
en presencia del material a ensayar, se ha llevado a cabo el ensayo
añadiendo a los frascos de cultivo un inóculo de microorganismos
viables, conteniendo 30, 15 y 6 unidades formadoras de colonias
(UFC) respectivamente de las cepas a estudiar. Estos inóculos son
inferiores al señalado en la Farmacopea (Eu Ph 2.6.27), que indica
que los medios de cultivo utilizados para el control microbiológico
de productos celulares, han de superar el ensayo de promoción de
crecimiento cuando se inoculan con menos de 100 microorganismos
viables de las cepas de referencia.
El inóculo de microorganismos viables se prepara a partir de
BioBall
®
SingleShot (Biomerieux), de las cepas patrón de microorga-
nismos recomendadas por la Farmacopea. Las BioBall
®
son unas esfe-
ras hidrosolubles que contienen 30 ± 2 UFC (SingleShot) de microor-
ganismos viables, envasadas en viales individuales, lo que disminuye
la variabilidad del inóculo y la posibilidad de contaminación con otras
cepas. Estas esferas se reconstituyen en 1 ml de solución salina esté-
ril, de modo que en 1- 0,5 – 0,2 mL de suspensión bacteriana habría
exactamente las 30 – 15 – 6 UFC necesarias para grupo del ensayo.
Se han comprobado los inóculos de cada cepa utilizada, sem-
brando una Bioball
®
en una placa de agar sangre.
Para verificar y documentar la
idoneidad
se han inoculado es-
tos microorganismos en botellas de hemocultivo en presencia y en
ausencia del producto celular a ensayar, de manera que se compru-
ebe que el producto no interfiere significativamente en el ensayo.
Para verificar y documentar la
reproducibilidad
de la técnica
se han realizado cuatro réplicas de 30 UFC, cinco réplicas de 15 UFC
y cinco réplicas de 6 UFC de cada una de las determinaciones (con
Fig. 1 Sistema automatizado BacT/Alert 3D60®.