INTRODUCCIÓN

Los cementos ionómero de vidrio son biomateriales utilizados en la protección y sellado del complejo dentinopulpar debido a su capacidad para adherirse a estructuras dentales, en especial a la dentina (1, 2). En este contexto, los biomateriales, además de sus buenas propiedades físicas, deben ser biocompatibles con la finalidad de promover la preservación del tejido pulpar y su normal funcionalidad. En este sentido, estudios previos han demostrado que los cementos ionómero de vidrio modificados con resina son más citotóxicos que los cementos ionómero de vidrio convencionales, esto es debido a la presencia de monómeros resinosos en su composición (3). Asimismo, se ha demostrado que los monómeros resinosos como el HEMA (2-hidroxietilmetacrilato), BIS-GMA (bis-glicidil- metacrilato), TEGDMA (trietilenglicoldimetacrilato) y UDMA (uretanodimetacrilato), son citotóxicos, al analizarlos por separado o bien en forma combinada, en dosis y tiempos diferentes sobre distintas líneas celulares (4-7). En consecuencia, esto exige por parte del profesional seleccionar el material adecuado para cada situación clínica valorando además el sustrato dentario donde va tomar contacto el biomaterial.

En la actualidad han surgido nuevos cementos ionómero de vidrio convencionales de alta viscosidad que permiten obturar en bloque de hasta 4 mm del biomaterial en una cavidad dentaria y de esta manera simplificar las maniobras operatorias. Esto es posible ya que se incorporaron cambios en la composición de estos biomateriales con la finalidad de aumentar la dureza, la resistencia y además mejorar su translucidez y coloración natural (8). De manera que estos biomateriales además de ser utilizados en dentina profunda como protectores del complejo dentino-pulpar, permiten en forma simultánea funcionar como materiales de restauración de una preparación cavitaria.

Los cambios en la composición de estos biomateriales exige realizar un control de calidad de los mismos analizando entre otras las propiedades de biocompatibilidad (9). En el control de calidad de la biocompatibilidad de biomateriales odontológicos los modelos experimentales in vitro son necesarios y recomendados por ANSI/ADA para conocer en profundidad los mecanismos de acción de los mismos (10); y en este sentido, en la actualidad se disponen de distintos ensayos que analizan la viabilidad celular teniendo en cuenta criterios morfológicos, bioquímicos y metabólicos (6, 11).

A partir de lo expuesto en este trabajo nuestro objetivo ha sido analizar la biocompatibilidad de dos cementos ionómero de vidrio convencionales de alta viscosidad en un modelo experimental in vitro de fibroblastos gingivales humanos utilizando criterios morfológicos, bioquímicos y metabólicos.

MATERIAL Y MÉTODOS

Cultivo celular y tratamiento.

Fibroblastos gingivales humanos fueron cultivados en un medio de cultivo DMEM rico en glucosa (Sigma-Aldrich Ref. D5796) suplementado con antibióticos-antimicóticos (100U/ml de penicilina G, 100 mg/ml de estreptomicina y 0.25mg/ml de anfotericina B; Sigma-Aldrich Ref. A5955) y suero bovino fetal (SBF) (Sigma-Aldrich Ref. F9665) al 10.0 %. Las células luego fueron cultivadas en placas de 24 pocillos a una concentración de 20000 células/500 µl de medio de cultivo DMEM, con 10.0 % SBF y antibióticos y se incubaron a 37º C con un 5.0 % de dióxido de carbono durante 24 horas. Cumplido este tiempo y obtenida la adhesión de las células a la base de cada uno de los pocillos, fueron lavados con PBS y recibieron 500 µl de medio de cultivo DMEM.

Los biomateriales utilizados fueron el cemento ionómero de vidrio EQUIA Forte Fil (EFT) (GC Corporation, Japan) y EQUIA Fil (EFL) (GC Corporation, Japan). Los mismos fueron preparados según las recomendaciones del fabricante e insertados en moldes siliconados cilíndricos con una apertura de 2 mm de diámetro y 1 mm de espesor. Los mismos fueron polimerizados por reacción química a los 5 minutos y posteriormente fueron extraídos de los moldes siliconados y colocados sobre un inserto (Transwell) que posee una membrana de poliester microporosa en la base con poros de 0,4 µm (Costar, Corning; Corning, NY, USA). Se incorporó a cada pocillo, con las células y los insertos, 1500 µl de medio de cultivo hasta cubrir el biomaterial. De esta manera se garantizó que las partículas del biomaterial que se desprendieran fluyeran a través de la membrana y tomaran contacto con las células. Las células sometidas a la acción de los distintos cementos ionómero de vidrio fueron analizadas a las 72 horas. Como control positivo (100% citotóxico) se utilizó Control Tritón X-100 al 2.0% (Sigma-Aldrich) (CT) y como control negativo (no citotóxico) se utilizó medio de cultivo DMEM (CM).

Análisis Morfológico.

Con el objetivo de analizar las posibles alteraciones morfológicas de los fibroblastos gingivales humanos tras la exposición a los diferentes cementos ionómero de vidrio las células adheridas a la superficie de los pocillos fueron observadas y analizadas con un microscopio óptico de luz invertida (Nikon Eclipse 90i, Tokio, Japan), como previamente fue descrito (3)

Análisis de proliferación celular mediante test WST-1.

Se determinó la biocompatibilidad de los distintos cementos de ionómero de vidrio usando el test de WST-1; para ello se retiró el sobrenadante del medio de cultivo de cada pocillo y las células fueron lavadas con PBS. Posteriormente se agregó a los pocillos una alícuota del reactivo de WST-1 (Roche, Germany) en una concentración de 10.0 µL en 100.0 µL de medio de cultivo. Las células fueron incubadas en esa solución durante 4 horas y posteriormente se evaluó la viabilidad usando un lector de placas (Biochrom® Asys UVM340) estableciendo como longitud de onda un rango de 450-620 nm.

Test de cuantificación de ADN libre.

Se identificó y cuantificó el ADN liberado al medio de cultivo como consecuencia de la muerte celular. Para ello, se tomó del sobrenadante de cada pocillo donde las células habían sido cultivadas, 10.0µL de medio y se llevó a un espectofotometro Thermo Scientific Nano drop 2000 (longitud de onda260-280 nm.).

Análisis estadístico.

Para determinar diferencias globales entre todos los grupos experimentales se empleó la prueba de Kruskal-Wallis. Los resultados con un valor de p < 0,05 se consideró como estadísticamente significativo.

RESULTADOS

Analisis morfológicos

Los fibroblastos gingivales humanos pertenecientes al control negativo (CM) y a los distintos cementos ionomero de vidrio EFT y EFL, se muestran con una morfología normal caracterizada por células con formas de finas prolongaciones alargadas o estrelladas (Figura 1 A, B, C). Por el contrario, las células del control positivo (CT) se muestran con alteraciones morfológicas caracterizadas por poseer formas esféricas y ruptura de sus membranas celulares (Figura 1 D).

Figura 1. Se observan las características morfológicas de los fibroblastos gingivales humanos de los grupos experimentales control negativo (A), control positivo (B), y de la exposición de las mismas a los cementos ionómero de vidrio de alta viscosidad Equia Fill (C) y Equia Forte (D) durante 72 horas.

Análisis de proliferación celular mediante test WST-1

Cuando evaluamos los fibroblastos gingivales humanos expuestos al cemento ionómero de vidrio EFT observamos valores de absorbancia de 1.840 ± 0.14 y un equivalente a proliferación celular del 95.73 %, mientras que cuando esas células son expuestas a EFL los valores de absorbancia fueron de 1.587 ± 0.086 y la proliferación celular del 82.61 %. Para el control positivo la absorbancia fue de 2.156 ± 0.032 y la proliferación celular del 100.0 %, mientras que para el control negativo los resultados fueron 0.23 de absorbancia y 0.0 % de proliferación celular (Figuras 2a y 2b, Tabla 1). Todos los grupos se diferenciaron significativamente entre sí (p<0.05).

Figura 2. Se representan los resultados de WST-1 expresados en valores de absorbancia (2A) y en porcentaje de proliferación celular (2B) de fibroblastos gingivales humanos expuestos a distintos cementos ionómero de vidrio de alta viscosidad Equia Forte (EFT) y Equia Fill (EFL) y de los controles positivo y negativo.

Tabla 1. Se observan los valores de significación estadística de contrastes múltiples entre grupos (p-valores) obtenidos mediante el test de Kruskal Wallis sobre los resultados de absorbancia del test de WST-1.

Test de cuantificación de ADN libre

La identificación de ADN liberado al medio de cultivo mostró que las muestras en la cual las células fueron expuestas a EFT (142.7 ± 5,5 µg), EFL (140 ± 2 µg) y el control positivo (139.6 ± 1.9 µg) constituyen un grupo homogéneo, sin diferencias estadísticamente significativas (p<0.05). Este grupo homogéneo si posee diferencias estadísticamente significativas (p>0.001) cuando se lo compara con el control negative (1241.7 ± 95.2 µg), en el cual se observan mayores concentraciones de ADN liberado al medio de cultivo (Figura 3, Tabla 2).

Figura 3. Se expresa la liberación de ADN al medio (μgr/μl) de fibroblastos gingivales humanos expuestos a distintos cementos ionómero de vidrio de alta viscosidad Equia Fill (EFL) y Equia Forte (EFT) y se exponen los resultados de los controles positivo y negativos.

Tabla 2. Se observan los valores de significación estadística de contrastes múltiples entre grupos (p-valores) obtenidos mediante el test de Kruskal Wallis sobre la concentración de ADN (μg/mL) liberado al medio de cultivo.

 DISCUSIÓN

Nuestros resultados permitieron determinar que los cementos ionómero de vidrio de alta viscosidad analizados en un modelo experimental in vitro de fibroblastos gingivales humanos mostraron niveles aceptables de biocompatibilidad.

Las razones por las que hemos utilizado fibroblastos gingivales humanos se deben a que diversos autores han demostrado que es un modelo experimental idóneo para valorar biocompatibilidad de biomateriales odontológicos, en especial cementos ionómero de vidrios, porque las mismas pertenecen a un entorno bucal y porque permiten realizar determinaciones morfológicas, bioquímicas y metabólicas con un alto grado de fiabilidad (3, 7, 12, 13).

Seleccionamos en este trabajo dos cementos de ionómero de vidrio de alta viscosidad, en este caso EFT y EFL, que son dos biomateriales que, si bien tienen el mismo objetivo, es decir, obturar una cavidad en bloque de 4.0mm y así simplificar las maniobras operatorias, poseen algunas variaciones en su composición química. En este sentido, (8) han valorado la citotoxicidad de ionomeros convencionales, pero ha incorporado una variante que es agregar a esos biomateriales nanoparticulas de hidroxiapatita y sílice con la finalidad de simular ionomeros de alta viscosidad.

Cuando analizamos la biocompatibilidad mediante la microscopia óptica para valorar determinaciones morfológicas, observamos que las células del control positivo y las expuestas a los ionómeros EFT y EFL presentaban formas ortotípicas caracterizadas por fibroblastos con aspectos ahusados o estrellados. Estos resultados coinciden con los mostrados por Rodriguez o Noorani donde los mismos observan que células en contacto con cementos ionómero de vidrio convencionales a las 72 horas presentaban las mismas formas. Asimismo, Noorani muestra similares resultados cuando pone en contacto un cemento ionómero de vidrio convencional de alta viscosidad. Sin embargo, cuando los cementos ionómero de vidrio incorporan resina en su composición, diversos autores han mostrado que las células sufren alteraciones morfológicas que se caracterizan por la presencia de células con formas redondas y ruptura de la membrana plasmática (3, 14, 15).

Cuando analizamos la proliferación celular observamos que con EFT fue del orden del 95,73% y EFL de 82,61 %, en ambos casos la viabilidad celular es alta, más si se la compara con el control negativo. De todas maneras, cuando a estos biomateriales los comparamos con el control positivo, observamos que la disminución de la viabilidad la diferencia fue estadísticamente significativa. Esa ligera disminución en la viabilidad podría deberse a la presencia de pequeñas partículas de aluminio y otros iones metálicos, entre ellos el zinc, presentes en los cementos ionómero de vidrio convencionales (16, 17). Nuestros hallazgos coinciden con Costa et al 1999, quienes utilizando el test MTT, un método con una misma fundamentación técnica a la por nosotros desarrollada, observaron que un cemento ionómero de vidrio convencional producía a las 72 horas citotoxicidad sobre células odontoblasticas MDPC-23, de todas maneras esa citotoxicidad era marcadamente inferior a la observada con los cementos ionómero de vidrio modificados con resinas.

En este trabajo se utilizó también para valorar viabilidad celular el test de ADN. Este método que permite detectar por espectrofotometría los fragmentos de ADN liberados al medio de cultivo ha sido utilizado por otros autores y ha mostrado un alto nivel de fiabillidad (18). En nuestro trabajo al analizar la biocompatibilidad mediante este test, se observó que los fibroblastos expuestos a los ionómeros EFT y EFL mostraban niveles de ADN similares al control negativo. Esto permite interpretar que tanto EFT y EFL no afectan la permeabilidad de la membrana nuclear de las células y por tanto confirman el carácter inocuo de estos biomateriales.

CONCLUSIÓN

La incorporación a los cementos ionómero de vidrio de hidroxiapatita y sílice no genera alteraciones celulares de magnitud en un modelo experimental in vitro de fibroblastos gingivales humanos. En este sentido, los cementos ionómero de vidrio de alta viscosidad podrían ser materiales de elección para resolver de manera más simple obturaciones que necesitan realizarse en cavidades en dentina profunda.

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INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO

Agradecimientos: Este trabajo ha sido financiado por: SECYT Codigo 313/16

Autor para la correspondencia Ismael Angel Rodriguez. Dirección: Calle Haya de la Torre s/n, Facultad de Odontología, Universidad Nacional de Córdoba, República Argentina. Email: ismaelrodriguez18@hotmail.com. Te: 00543514333033/32.