Introducción

La mortalidad del paciente con sepsis asociada a bacteriemia está directamente asociada con la implantación de un tratamiento antibiótico empírico inadecuado (1). Se estima que entre un 28 y un 34% de tratamientos empíricos que se instauran para el tratamiento de una sepsis son inadecuadas (2-4). Por ello, se necesitan esquemas terapéuticos empíricos optimizados para contribuir a evitar la aparición y diseminación de resistencias microbianas debidas a un uso inadecuado de antimicrobianos en diversas situaciones clínicas, así como mejoras en la rapidez y calidad del diagnóstico etiológico de bacteriemia. Entre las innovaciones metodológicas, la espectrometría de masas permite hacer un diagnóstico etiológico rápido en la rutina asistencial para el diagnóstico de la bacteriemia.

La espectrometría de masas ha sido utilizada en distintos aspectos relacionados con la identificación bacteriana desde 1980 (5-9), pero a partir de 2009, el sistema MALDI-TOF MS® (matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight) comienza a utilizarse para el diagnóstico microbiológico, gracias a un protocolo de identificación de microorganismos basado en su perfil proteómico. Diversos autores han comparado esta tecnología tanto con los métodos tradicionales del laboratorio de microbiología (10-11), como con equipos basados en reacción de la cadena polimerasa a tiempo real tales como LightCycler SeptiFast, Roche Molecular Systems (PCR) (12-13). Frente a las pruebas bioquímicas, la rapidez es la gran ventaja de la tecnología de MALDI-TOF, mientras que frente a los métodos rápidos de PCR, la menor laboriosidad permite mejorar los flujos de trabajo en los laboratorios asistenciales, y su menor coste económico permite mejoras en las medidas de contención del gasto.

La aplicación de esta tecnología al estudio de los hemocultivos permite hacer el diagnóstico etiológico de la bacteriemia en minutos a partir del momento en que se positivizan los frascos, permitiendo por tanto hacer un tratamiento antibiótico dirigido a través de la identificación del microorganismo causal, con el consiguiente beneficio para el paciente.

En nuestro estudio presentamos los resultados de la implementación de un esquema de diagnóstico etiológico rápido de bacteriemia basado en la utilización del kit Sepsityper® seguido de la espectrometría de masas MALDITOF-MS®, para la identificación rápida de microorganismos a partir de hemocultivos positivos, determinando el grado de concordancia de resultados respecto a los métodos clásicos de diagnóstico microbiológico del agente etiológico de bacteriemia, y el beneficio en tiempo de adelanto que ofrece esta tecnología a la hora de permitir establecer un tratamiento antibiótico adecuado en un paciente séptico grave.

Material y métodos

Durante un periodo de tiempo de diez meses se compararon los resultados de 379 frascos de hemocultivos (BacT/ALERT®, Biomérieaux) con crecimiento bacteriano positivo correspondientes a 166 pacientes hospitalizados en el Hospital Universitario San Cecilio. Los frascos de hemocultivo positivos procedían de distintas tomas de pacientes (en condiciones atmosféricas de aerobiosis y anaerobiosis) durante la evolución clínica del paciente.

La distribución de los pacientes fue la siguiente: 15 pacientes pediátricos y 151 pacientes adultos (90.96% de la muestra), de los cuales el 64.45% fueron mujeres (107/166), con una mediana de edad de 55 años (37-71). La totalidad de las muestras pediátricas procedieron de la Unidad de Cuidados Intensivos Pediátricos del hospital, mientras que las 151 muestras de pacientes adultos analizadas, tuvieron la siguiente distribución por Servicios: 44.37% procedieron del área de urgencias externas (67/151); 54/151 procedían de áreas no quirúrgicas (35.76%); y 30 pacientes estudiados estaban hospitalizados en áreas quirúrgicas (14/151) o UCI del hospital (22/151, 14.5%).

Todas las muestras fueron procesadas según el algoritmo diagnóstico para el estudio de bacteriemia de nuestro laboratorio: tinción de gran a los frascos positivos y posterior reaislamiento en los medios de cultivo adecuados. La identificación de los microorganismos se realizó mediante WIDER® para bacilos GRAM negativo y cocos GRAM positivos (F. Soria-Melguizo), VITEK-2® para levaduras (Biomérieaux); y API ANA para bacterias anaerobias (Biomérieaux).Para la identificación de estreptococos y neumococos se utilizó la prueba de susceptibilidad a la bacitracina y a la optoquina.

De forma paralela, los frascos positivos se utilizaron para su procesamiento directo para identificación por el sistema de espectrometría de masas MALDITOF-MS® -MS (Bruker), utilizando el kit Sepsityper® (Bruker), para ello utilizamos 1 ml de hemocultivo, lo sometemos a un proceso de lisis con solución LYSIS BUFFER (LB), centrifugamos y lavamos con la solución WASHING BUFFER (WB). Posteriormente se añade al pellet 300 µl de agua HPLC y 900 µl de alcohol. Centrifugamos el eppendorf a 16000 rpm y añadimos ácido fórmico y acetonitrilo. Finalmente centrifugar y depositar 1µl del sobrenadante en la pletina proporcionada por el fabricante. Añadir 1µl de matriz (ácido -alfa-ciano-4-hidroxicinámico) y hacer la lectura automatizada en el sistema MS MALDITOF® Autoflex III (Bruker Daltonics), el cual posee un software (FlexAnalysis Biotyper 3.3 (Bruker Daltonik) que analiza los distintos perfiles proteínicos obtenidos y puntúa automáticamente con scores de 0 a 3 en función de la fiabilidad de la identificación obtenida, siendo considerada como una identificación no fiable a nivel de género ni de especie del microorganismo cuando se obtiene un score inferior al 1,699. Identificación probable a nivel de género si se obtiene un score entre 1,700 y 1,999. Identificación segura a nivel de género y probable a nivel de especie si el score está comprendido entre 2,000 y 2,299. Y alta probabilidad de identificación de especie si el score está comprendido entre 2,300 y 3,000.

Los datos obtenidos se han analizado mediante distribución de frecuencias absolutas y relativas. Para las variables continuas se presenta el número de observaciones válidas así como estadísticas que describan el promedio y la distribución de la distribución (media ± desviación estándar). Para la estimación de la correlación entre técnicas se estima el Índice de Correlación Kappa de los resultados obtenidos por ambas técnicas, el cual establece una fortaleza de concordancia de resultados excelente cuando el índice es de 0.81-1, bueno si es entre 0.61-0.8, moderado si 0.41-0.6, ligero si 0.21-0.4, y malo si menor de 0.2.

Resultados

La distribución de los aislamientos estudiados en los 166 pacientes fue de un 25.3% de Bacilos GRAM Negativos (BGN, n=42), y de un 74.7% de Cocos GRAM Positivos (CGP, n=124) de los cuales 89 fueron bacteriemias causadas por Estafilococos coagulasa negativo (ECN), 13 por S. aureus, 4 por microorganismos pertenecientes al género Enterococcus, 6 pertenecieron al grupo St. viridans y 1 St. pneumoniae. Finalmente se diagnosticaron 11 bacteriemias causadas por otros microorganismos GRAM positivo: 1 Corynebacterium spp, 2 casos de Bacillus circulans, 1 bacteriemia por Listeria monocytogenes; 4 por Micrococcus luteus; 2 Clostridium perfringens y un Propinebacterium acnés.

La concordancia global de resultados entre la identificación por MS MALDITOF® y la identificación tradicional ha sido del 98.7% respecto al género de los microorganismos implicados, y del 95.8 % respecto a su especie. Estos datos, cuando se separan entre microorganismos GRAM negativos (GN) y GRAM positivos (GP), pasan a 100% de concordancia en género en los GN (95.2% de concordancia en especie); y del 98.2% de concordancia en género en GP (82.5% en especie).

La correlación en la identificación de los bacilos GRAM negativo fue excelente, tanto para el género como para la especie. Sólo hubo un caso en el que la ID convencional (Wider) fue Aeromonas hydrophila mientras que la identificación por MALDITOF-MS® fue Aeromonas veronii (14).

Respecto a la identificación de los microorganismos GRAM positivos, destaca la concordancia del 100% en todos los casos de Staphylococcus aureus (13/13) (15), y Enterococcus (4/4) (16). Sin embargo, dentro del grupo de Estafilococos Coagulasa Negativo (ECN) (17), el porcentaje de correlación de identificación en género fue del 98.9% debido a una discrepancia, donde el sistema MALDITOF-MS® identificó como Rothia mucilaginosa, mientras que la identificación convencional a través de identificación automatizada por sistema WIDER® lo identificó como S epidermidis. Respecto a la identificación a nivel de especie en ECN, la concordancia fue del 86.5% debido a que el sistema WIDER® identificó 11 casos de bacteriemia por Staphylococcus hominis, mientras que MALDITOF-MS® identificó 9 casos de Staphylococcus epidermidis, 1 caso de Staphylococcus warnerii, y otro caso de Staphylococcus simulans. Finalmente MALDITOF-MS® diagnóstico un caso S hominis que por el contrario el sistema WIDER® lo identificó como S haemolyticus. En relación al género Streptococcus, la identificación a nivel de especie fue del 66.7%, debido a que de los dos casos en los que la identificación por MALDITOF-MS® resultó ser Streptococcus pneumoniae, dicha identificación no se correlacionó con la identificación realizada mediante métodos bioquímicos tales como la sensibilidad en disco-placa a la optoquina y la bacitracina, las cuales fueron complementadas con baterías comerciales API-Strept® (Biomérieaux). Respecto a los aislamientos de bacilos GRAM positivo (BGP), solo analizamos 4 casos de BGP aerobios (1 Corynebacterium spp, 2 casos de Bacillus circulans, 1 bacteriemia por Listeria monocytogenes); y 3 casos de BGP anaeróbicos (2 Clostridium perfringens y un Propinebacterium acnés). En todos los casos la concordancia de resultados tanto en género como en especie fue del 100% por ambos sistemas de identificación. Todos los datos del estudio de concordancia se describen en la Tabla1.

Tabla 1. Porcentajes de concordancia de resultados entre los dos sistemas de identificación automatizada en evaluación: Sistema de identificación automatizada WIDER / VITEK2 vs Espectrometría de masas MALDITOF MS®.

Nuestra principal limitación a la hora de obtener un resultado tras análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF MS ha sido la no obtención del pellet tras la centrifugación del mililitro de hemocultivo positivo junto a la solución Lysis buffer. En nuestro estudio esto sólo ha ocurrido en 5 casos (1,3%), no obteniendo finalmente una identificación del microorganismo por medio de MALDI-TOF MS.

Discusión

La importancia de la mortalidad asociada al retraso en el inicio de un tratamiento antibiótico correcto en la actualidad condiciona al microbiólogo clínico a adaptar sus protocolos diagnósticos, en especial en el caso de la bacteriemia. La rapidez y relativa sencillez del uso de la espectrometría de masas ya ha demostrado su utilidad en comparación con otros sistemas diagnósticos en el laboratorio de microbiología (18-21). El diagnóstico del agente etiológico productor de la bacteriemia requiere el cultivo previo del microorganismo en medio sólido desde los frascos de hemocultivo positivo, lo que supone un retraso de al menos 8-24 horas. Aunque la tinción de gram del hemocultivo positivo es informativa, la posibilidad de disponer en ese mismo momento de la identificación de género y especie supone un gran avance, que tiene una inestimable aplicación tanto en la clínica como en la gestión de los costes en antibioterapia y en días de ingreso hospitalario (22). Con este método de trabajo hemos conseguido adelantar el resultado de la identificación del microorganismo causante de bacteriemia en 17 a 23 horas durante la jornada laboral y de 13 a 16 horas en periodo de continuidad asistencial. Siendo nuestro volumen de trabajo de una media de 7 frascos de hemocultivo positivos al día durante la jornada laboral y 2 durante el periodo de continuidad asistencial, utilizamos este nuevo método de identificación en un frasco de hemocultivo positivo (aeróbico y anaeróbico) de una de las distintas tomas de cada paciente (una, dos o tres tomas de hemocultivo). Reaislando el resto de frascos de las distintas tomas en medios de cultivo para su posterior identificación mediante pruebas bioquímicas convencionales.

En nuestro estudio hemos implementado un nuevo método para el tratamiento de los hemocultivos positivos, como paso previo a su análisis mediante MALDITOF-MS®. Hasta el momento, diversos autores han mostrado los resultados de la aplicación de diferentes protocolos para procesar el hemocultivo positivo (23), que incluyen desde el volumen de sangre de hemocultivo utilizado y la centrifugación hasta diversos protocolos de extracción, sin un notable grado de estandarización.

Los resultados de nuestro trabajo muestran un grado de concordancia excelente respecto otros métodos de identificación, destacando su utilidad en todos los casos de bacteriemias causadas por bacilos GRAM-negativos, Staphylococcus aureus, microorganismos del género Enterococcus, y bacterias anaeróbicas. No obstante hay que remarcar las limitaciones de esta tecnología en dos situaciones clínicas: la primera, de gran trascendencia, la bacteriemia por Streptococcus pneumoniae y la posibilidad de confusión por parte del sistema MALDITOF MS® con Streptococcus del grupo viridans (18,24). Este fallo, bien conocido del sistema MALDITOF-MS®, se debe según algunos autores, a la gran similitud a nivel proteómico de múltiples especies de streptococcus, hasta el punto de ser necesario hacer genotipado molecular de las mismas para su correcta diferenciación (25); la segunda, de mucha menor trascendencia clínica, es el caso de la asignación de especie para los estafilococos coagulasa negativos, en los que el porcentaje de concordancia en especie desciende al 86.5%. Hay que destacar, que en ningún caso hubo discordancias con la identificación de Staphylococcus aureus, y en todos los casos de discrepancia a nivel de especie no supuso ningún cambio en el manejo clínico del paciente. Queda aún por esclarecer si la identificación correcta en estos casos es atribuible a errores en la tecnología MALDITOF-MS® o por el contrario se deben a errores en la identificación convencional. La secuenciación del ARN16S y el posterior análisis filogenético de las secuencias habría permitido establecer cuál de los dos sistemas estaba emitiendo el resultado correcto (25).

En resumen, presentamos un estudio en el que se utiliza el kit Sepsityper (Bruker) y la espectrometría de masas MALDITOF-MS® para la identificación de patógenos directamente a partir de frascos de hemocultivos positivos. Esta es una herramienta rápida y fiable para la identificación del agente etiológico responsable de bacteriemia en menos de 30 minutos, y sus hallazgos aportan una importante información para la toma de decisiones acerca de la antibioterapia empírica instaurada.

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INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO

Autor para la correspondencia: Raquel Camacho Luque. Servicio de Microbiología. Hospital Universitario San Cecilio. Granada. Avda. Doctor Oloriz, 16. 18012 Granada, España email: raquelcluque@hotmail.com