Revista nº 797

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16 Fernando Campos
Evaluación de viabilidad celular en constructos
La concentración media en mmoles/kg de peso en seco y la
desviación estándar de los elementos químicos intracelulares en
los fibroblastos cultivados en rejillas durante 7 y 21 días fueron
respectivamente: Na (32, 91 ± 7,75 y 61,87 ± 15,74), Mg (42,02 ±
7,79 y 18,40 ± 6,51), P (314,13 ± 43,81 y 333,82 ± 85,98), S (165,83
± 27,40 y 129,24 ± 20,78), Cl (77,66 ± 13.09 y 118,20 ± 24,02),
K (488,07 ± 78,22 y 190,49 ± 50,78) y Ca (5,95 ± 6.08 y 162,08 ±
38,37). La concentración media en los fibroblastos presentes en el
interior de los constructos a los 7 y 21 días fue respectivamente la
siguiente: Na (87,87 ± 26,10 y 59,96 ± 14,91 ), Mg (24,24 ± 12,17 y
18,24 ± 6,46), P (219,01 ± 27,07 y 347,94 ± 83,97), S (130,66 ± 31,57
y 121,33 ± 32,73), Cl (88,92 ± 17,80 y 119,75 ± 23,51), K (169,84 ±
33,30 y 193,71 ± 53,85) y Ca (47,00 ± 28,92 y 182,23 ± 57,57). En las
Figs. 4 y 5 se expresa el perfil iónico promedio de los ensayos reali-
zados a los 7 y 21 días. Finalmente los índices de viabilidad celular
K/Na en las células en cultivo y en las células del constructo tisular
alcanzaron respectivamente los siguientes valores 14,83 y 1,93 a
los 7 días y de 3,07 y 3,23 a los 21 días (Fig. 6).
DISCUSIÓN
La eficacia terapéutica de los constructos elaborados por in-
geniería tisular depende de factores muy diversos como por ejem-
plo la naturaleza del biomaterial utilizado y las propiedades reoló-
gicas del mismo o del tipo de célula seleccionado. En relación con
estas últimas es importante señalar que solo el uso de poblaciones
celulares con un grado elevado de viabilidad puede garantizar el
éxito y la eficacia terapéutica (5, 6, 23-25).
La evaluación de los perfiles de viabilidad de las células a uti-
lizar en los constructos generados por ingeniería tisular constituye
por tanto uno de los objetivos fundamentales en los protocolos de
control de calidad a la hora de autorizar su traslación a la clínica.
Como se ha indicado en la introducción los métodos habituales de
evaluación de viabilidad basados en la identificación de las alte-
raciones de la membrana celular y del estado metabólico celular
presentan limitaciones importantes que la utilización de la micros-
copia electrónica analítica por dispersión de Rayos X ha comenzado
recientemente a superar (5, 6, 23-26). La evaluación de la viabilidad
en los protocolos actualmente existentes se realiza sin embargo en
las células aisladas con anterioridad a su utilización en el constructo
sin que existan datos fidedignos sobre las variaciones en el grado
de viabilidad que pueden sufrir las células en seno del constructo.
Entre los biomateriales que recientemente han demostrado
una mayor eficacia en la construcción de nuevos tejidos aptos para
la terapéutica está la fibrina (27, 28). Se trata de un polímero na-
tural biodegradable que participa de los procesos naturales de re-
paración tisular y que posee cadenas fibrilares largas que permiten
flexibilidad y una elevada fuerza mecánica (29). Recientemente se
ha descrito además que la unión de la fibrina con la agarosa, que es
un extracto de alga marina, refuerza las propiedades mecánicas del
conjunto y que regulando la hidratación y la presión el biomaterial
formado puede adquirir, en un amplio espectro, las propiedades
biomecánicas deseadas (9, 14, 30). Los constructos elaborados con
fibrina agarosa y fibrobastos han demostrado asimismo una gran
capacidad para constituir estromas artificiales biomiméticos para
distintos tipos de tejidos y órganos (8, 10, 12, 14, 15, 31).
En el presente trabajo se ha aplicado un protocolo de eva-
luación microanalítica celular con el objeto de cuantificar el perfil
iónico de los fibroblastos inmersos en el material de fibrina agarosa
de los constructos. A tal efecto la evaluación de la viabilidad de los
mismos se llevó a cabo a los 7 y 21 días y se utilizaron como con-
troles para la evaluación los fibroblastos aislados cultivados en el
mismo periodo de tiempo. Además se utilizó otra técnica clásica
para evaluar viabilidad -la técnica de Live Dead- que constituye una
metodología básica utilizada habitualmente para determinar la via-
bilidad de los elementos celulares aislados.
Los resultados obtenidos con la utilización de la técnica de
Live/Dead demuestran que la viabilidad de los fibroblastos orales
aislados supera a los 7 y 21 días el 90% y que cuando se aplica a
la evaluación de las células que forman parte de los constructos
tisulares de fibrina agarosa la viabilidad se reduce a los 21 días a
un 61,4%. De acuerdo con estos datos los constructos tisulares de
fibrina agarosa tendrían una elevada viabilidad en su componente
celular lo que garantizaría en gran medida su eficacia biológica.
Cuando se evalúan los fibroblastos aislados aplicando el pro-
tocolo de microscopia electrónica a analítica se observa un elevado
índice K/Na a los 7 días y una disminución significativa a los 21 días
aunque alcanza sin embargo un valor de 3,07. El índice K/Na se
considera el marcador más importante para determinar la viabili-
dad celular al reflejar la relación del potasio intracelular con el so-
dio, que posee baja concentración intracelular en las células viables
y elevada concentración intracelular en las células no viables (32).
En los constructos de fibrina agarosa el índice K/Na ascien-
de desde 1.93 a los 7 días hasta 3.23 a los 21 días con cifras de
viabilidad similares a las de los fibroblastos aislados. El hecho de
que los fibroblastos tengan un índice de viabilidad semejante a los
21 días, tanto en aislamiento como en el seno de los constructos,
refleja, con independencia de los medios de cultivo, que en el seno
del biomaterial de fibrina agarosa los fibroblastos en ambos casos
alcanzan una viabilidad elevada. La existencia de una elevada con-
centración de fósforo en los fibroblastos aislados y en los de los
constructos tisulares, tanto a los 7 días como a los 21 días, es otro
signo importante de viabilidad al correlacionarse dicho elemento
con el componente orgánico de la célula (32).
Los resultados obtenidos por otra parte en relación con el
cloro son importantes en nuestro estudio porque demuestran que
las concentraciones de dicho elementos se mantienen elevadas y
similares en los fibroblastos aislados y los existentes en el seno de
los constructos, tanto a los 7 como a los 21 días. El mantenimien-
to elevado de la concentración de cloro significa que la población
celular en ambos casos no se encuentra en apoptosis ya que la dis-
minución de cloro junto a la bajada de potasio constituye el perfil
microanalítico de dicho proceso, lo que se asocia también a una
pérdida de volumen celular (33, 34). Ninguna de las dos circunstan-
cias se da en los ensayos realizados.
CONCLUSIÓN
En consecuencia nuestro estudio demuestra que la evalua-
ción de la viabilidad celular en constructos tisulares con microscopia
electrónica analítica por dispersión de rayos-X es factible y que los
resultados preliminares indican que las células en los constructos de
fibrina agarosa poseen una viabilidad elevada a las tres semanas de
su elaboración sin signos microanalíticos de apoptosis. Futuros es-
tudios deben determinar si estos resultados pueden generalizarse a
constructos elaborados con otros biomateriales o pueden variar en
constructos de fibrina agarosa elaborados con protocolos diferentes .
AGRADECIMIENTO
Los autores agradecen a las Profesoras Allice Warley
) y María del Carmen Sánchez-Quevedo (Universidad de
Granada) por el asesoramiento recibido en el desarrollo de las técnicas
de microscopía electrónica analítica por energía dispersiva de rayos-X.
BIBLIOGRAFÍA
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