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Fernando Campos
Evaluación de viabilidad celular en constructos
intracelulares de los principales elementos químicos vinculados
a la viabilidad celular como el potasio, el sodio y el cloro. La uti-
lización de esta técnica ha permitido cuantificar la viabilidad ce-
lular en cultivo de tipos celulares muy diversos (4-8). Uno de los
retos existentes en el momento presente consiste precisamente
en adaptar esta técnica para su utilización en los constructos ya
elaborados al objeto de poder evaluar la viabilidad de las células
que lo componen.
En el presente trabajo se realiza un estudio preliminar
sobre la adaptación y aplicación de dicha técnica a los cons-
tructos tisulares de fibrina agarosa, cuya versatilidad y ventajas
biomiméticas han sido ampliamente demostradas (9-11), con
el objeto de disponer en el futuro de una metodología idónea
para evaluar la viabilidad de las células insertas en el mismo.
Ello podría conducir a un control de calidad más exigente de
acuerdo con los requerimientos que demanda este nuevo tipo
de terapia.
MATERIALES Y MÉTODOS
1. GENERACIÓN DE CONSTRUCTOS TISULARES
Los fibroblastos, procedentes de mucosa oral de cinco su-
jetos sanos, según el protocolo previamente descrito (8, 12, 13),
fueron introducidas DMEM (Sigma-Aldrich) suplementado con
antibióticos (500 U/ml de penicilina G y 500 µg/ml de
estrepto-
micina) y
antimicóticos (1,25 µg/ml de anfotericina B) (Sigma-
Aldrich). Tras el lavado en una solución estéril de PBS con peni-
cilina, estreptomicina y anfotericina B (500 U/ml, 500 µg/ml y
1,25 µg/ml, respectivamente) las muestras fueron incubadas a
37ºC en una solución estéril de colagenasa tipo I de Clostridium
hystoliticum (Gibco BRL Life Technologies Ref. 17100-017, Karls-
ruhe, Alemania) al 2% en medio de cultivo DMEM durante 10-12
horas. Para los cultivos primarios se utilizó DMEM enriquecido
en glucosa (Sigma-Aldrich) suplementado con antibióticos y an-
timicóticos (100 U/ml de penicilina G y 100 µg/ml de estrepto-
micina y 0,25 µg/ml de anfotericina B; Sigma-Aldrich) y suero
bovino fetal (SBF) (Sigma-Aldrich) al 10%. Las células fueron
incubadas a 37ºC y 5% de dióxido de carbono, en condiciones
estándar de cultivo celular. Los cultivos de fibroblastos se expan-
dieron hasta el cuarto subcultivo, en nuevos frascos de cultivo,
antes de su uso para la fabricación los constructos tisulares.
Para la generación de biomateriales de fibrina humana y
agarosa tipo VII (Sigma-Aldrich) al 0,1%, se utilizó plasma san-
guíneo humano siguiendo las normas y recomendaciones de la
Asociación Española de Bancos de Tejidos (AEBT). Como agen-
te inhibidor de la fibrinolisis del biomaterial utilizamos ácido
tranexámico (Amchafibrín
®
, Fides Ecofarma, Valencia, España)
y Cl
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Ca 1% (p/v) para inducir la polimerización del plasma y la
conversión del fibrinógeno en fibrina. Se realiza el control mi-
croscópico de la elaboración del biomaterial mediante micros-
copía electrónica de barrido en un microscopio PHILIPS Quanta
200, siguiendo procedimientos estandarizados
(9).
La elaboración del constructo, se lleva a cabo utilizando
el protocolo descrito para la generación constructos de córnea,
mucosa oral y piel (8, 12, 14, 15). Para ello, 500.000 fibroblas-
tos fueron resuspendidos en 2 ml de medio de cultivo DMEM,
y añadidos al biomaterial de fibrina agarosa elaborado según
se ha indicado previamente. Se realiza el control microscópico
mediante microscopía electrónica de barrido en un microscopio
PHILIPS Quanta 200, siguiendo los procedimientos estandariza-
dos (9).
2. DETERMINACION DE LA VIABILIDAD CELULAR EN LOS FI-
BROBLASTOS AISLADOS Y DEL CONSTRUCTO TISULAR
La determinación de la viabilidad mediante la técnica de
LIVE/DEAD nos permite realizar un ensayo funcional, en base a
la integridad de su membrana plasmática. Para la realización de
este ensayo de viabilidad en células aisladas se cultivaron 10000
fibroblastos en placa estéril, de cultivo celular, de 96 pocillos
(Lab-Tek II, Nunc, Rochester, NY, USA), durante 7 y 21 días res-
pectivamente. Se utilizaron los fluorocromos del kit comercial
LIVE/DEAD Viability/citotoxicity kit for mammalian cells (Invi-
trogen, Oregon, USA) diluidos en PBS. Se añadió a cada pocillo
100 µl de solución con fluorocromos y se dejó incubar durante
10 minutos. Inmediatamente después se procedió a la toma de
imágenes con un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse
Ti-U (Nikon Instruments Inc, NY, USA). Las longitudes de onda de
excitación de los fluorocromos fueron 494 nm para la calceína
y 528 nm para el bromuro de etidio, respectivamente. Poste-
riormente, los recuentos celulares se efectuaron con ayuda del
software ImageJ.
Para la determinar la viabilidad en los constructos tisulares
se tomaron pequeños fragmentos de los constructos cultivados
durante 7 y 21 días y se depositaron en unos portas. Posterior-
mente, se añadió 100µl de una disolución de acetometoxi-calceí-
na y compuesto de etidio y se dejó incubar durante 10 minutos.
Inmediatamente después se procedió a la toma de imágenes con
un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse Ti-U (Nikon Instru-
ments Inc, NY, USA), siguiendo el protocolo arriba indicado.
Para realizar el estudio de la viabilidad con Microscopia
electrónica analítica por energía dispersiva de Rayos X en los
fibroblastos aislados se siguió el siguiente protocolo: tras cubrir
las rejillas de oro con pieloformo (SPI-CHEM ref. 2466) las célu-
las mantenidas en cultivo se tripsinizaron y se cultivaron sobre
dichas rejillas. Se procedió posteriormente al lavado de las reji-
llas, conteniendo las células, de acuerdo con los criterios esta-
blecidos previamente por diferentes autores (4, 16-18) eligien-
do como solución lavadora agua destilada a una temperatura
de 4ºC, durante 5 segundos. La solución lavadora se mantiene
en movimiento constante por agitación magnética (16).
Las re-
jillas fueron criofijadas mediante inmersión rápida en nitrógeno
líquido. Las rejillas con las células criofijadas se introdujeron en
un portamuestras de aluminio preenfriado a -196ºC. Las célu-
las criofijadas y en el interior del portamuestras fueron poste-
riormente criodesecadas de forma inmediata en un sistema de
criodesecación de alto vacio Emitech K775 (Emitech, Watford,
UK) durante un total de 17 horas a una presión de vacío de 10-5
mbar de acuerdo con los criterios de Warley y Skepper (24). Tras
la criodesecación las rejillas criodesecadas y montadas sobre
portamuestras de aluminio fueron recubiertas con una capa de
carbón, durante 30 segundos, en una unidad de recubrimien-
to sputtering Emitech K775 Watford, UK empleándose argón
(P=10
-5
mbar) (20). El análisis microscópico y microanalítico de
las muestras se realizó en un microscopio electrónico de barrido
ambiental PHILIPS Quanta 200 provisto de un detector de ener-
gía dispersiva de rayos X (EDAX-DX4). Las constantes utilizadas
para realizar el estudio microanalítico fueron las siguientes: vol-
taje 10 kV, aumentos 10000, ángulo de superficie 0º, cuentas
por segundo (CPS) registradas por el detector 500, tiempo de
acumulación de cuentas 200 segundos, tamaño del haz de elec-
trones (spot size) 5, distancia de trabajo 10mm. La determina-
ción de la viabilidad se realiza a los 7 y 21 días de cultivo.
Para determinar la viabilidad de los fibroblastos en los
constructos tisulares de fibrina agarosa se procede al lavado
de los mismos siguiendo el protocolo arriba indicado y poste-
riormente se criofijan mediante inmersión rápida en nitrógeno
líquido. Las muestras criofijadas fueron depositadas sobre papel
de filtro y colocadas en un portamuestras de aluminio preen-
friado a -196ºC. La criodesecación, el montaje y el recubrimien-
to sigue asimismo las pautas previamente descritas.
El análisis
microscópico y microanalítico de las muestras se realizó en un
microscopio electrónico de barrido ambiental PHILIPS Quanta
200 provisto de un detector de energía dispersiva de rayos X
(EDAX-DX4) con los mismos parámetros y condiciones indicados
con anterioridad.
Para la realización de los estudios microanalíticos cuantita-
tivos se sigue el protocolo previamente descrito para fibroblas-
tos de mucosa oral por Sánchez Quevedo et al., 2007 (8) que
utiliza el método de la razón Pico/fondo (4, 21, 22) y estándares
elaborados con concentraciones conocidas de sales inorgánicas
en 20% de dextrano (16).