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Fernando Campos
Evaluación de viabilidad celular en constructos
RESULTADOS
El cultivo primario de fibroblastos mostró un crecimiento ce-
lular muy rápido a partir de los primeros días. A las 24h la mayor
parte de las células se encontraban adheridas al fondo del frasco de
cultivo y emitían pequeñas prolongaciones a modo de pseudópo-
dos. El crecimiento de los fibroblastos se evidenció entre las 48 y 72
horas de cultivo, configurándose al quinto día, una trama celular,
constituida por células con largas prolongaciones, que a partir del
séptimo día, se convierte en una masa de células fusiformes que
ocupaba toda la superficie del cultivo. Por otra parte la observación
con microscopía electrónica de barrido del biomaterial de fibrina
agarosa elaborado puso de relieve que el biomaterial está consti-
tuido en todo su espesor por una red filamentosa homogénea (Fig.
1a). Los fibroblastos incluidos en los geles de fibrina y agarosa mos-
traron una morfología alargada o estrellada y una distribución ho-
mogénea en la trama reticular de fibrina. En ninguno de los casos
se apreció contracción o pérdida de volumen de los geles de fibrina
y agarosa después de generar los constructos (Fig. 1b).
Los resultados del ensayo de fluorescencia LIVE/DEAD
realizados en los fibroblastos en cultivo mostraron siempre un
porcentaje de viabilidad superior al 85%. Para los fibroblastos
cultivados durante 7 días, las células vivas presentaron un por-
centaje promedio de 92,01 ± 4,66 y para los fibroblastos culti-
vados durante 21 días 91,68 ± 3,90 (Fig. 2a y 2b). Los resultados
del ensayo de fluorescencia Live/Dead en los constructos tisula-
res mostraron un porcentaje de viabilidad del 87% y del 61,4%
respectivamente para los constructos cultivados durante 7 y 21
días respectivamente (Fig. 3a y 3b).
Para cada una de las células, objeto de estudio, en los en-
sayos de viabilidad con microscopia electrónica analítica por
energía dispersiva de rayos-X (10 en cada ensayo), se obtuvieron
espectros individualizados. En cada espectro se observaron los pi-
cos correspondientes a los diferentes elementos existentes a ni-
vel intracelular, así como el fondo o background, correspondiente
a la emisión de la radiación no característica.
Figura 1. Microfotografía con microscopia electrónica de barrido
del biomaterial de fibrina agarosa (A) (3000x) y del constructo de
fibrina agarosa con células (B) (5000x).
Figura 3. Microfotografía con microscopio óptico invertido de
constructos tisulares tras el ensayo Live/Dead. En verde (calceina)
marcadas las células vivas con actividad esterasa. En rojo
(bromuro de etidio) marcados los núcleos de células muertas y con
membranas alteradas. A) Constructos tisulares de 7 días (10x). B)
Constructos tisulares de 21 días (10x).
Figura 2. Microfotografía con microscopio óptico invertido de
fibroblastos tras el ensayo Live/Dead. En verde (calceina) marcadas
las células vivas con actividad esterasa. En rojo (bromuro de etidio)
marcados los núcleos de células muertas y con membranas alteradas.
A) Fibroblastos cultivados durante 7 días (10x). B) Fibroblastos
cultivados durante 21 días (10x).
Figura 4. Concentración media y desviación estándar de Na, Mg,
P, S, Cl, K y Ca en fibroblastos cultivados en rejillas durante 7 días
y 21 días.
Figura 5. Concentración media y desviación estándar de Na, Mg, P, S,
Cl, K y Ca en constructos tisulares a los 7 y 21 días.
Figura 6. Indice K/Na en fibroblastos aislados y constructos tisulares a
los 7 y 21 días