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Raquel Camacho-Luque
Espectrometría de masas para identificación de micobacterias
Este hecho impide que penetren los colorantes habituales de anili-
na, por lo que no se pueden ver en la tinción de Gram, y hace que
para poder visualizarlas sean necesarios colorantes especiales (aril-
metanos), pero que una vez teñidas no se decoloran con una mezcla
de alcohol y ácido (1). Las micobacterias son capaces de sobrevivir
durante semanas o meses sobre objetos inanimados, siempre que
estén protegidas de la luz solar, y son más resistentes a los ácidos,
álcalis y desinfectantes que el resto de las bacterias no formadoras
de esporas. Resisten la desecación y la congelación, pero la luz ultra-
violeta y el calor (>65º C durante 30 minutos) las inactiva.
Mycobacterium tuberculosis, M bovis, M africanum
son los
agentes etiológicos de la tuberculosis en el hombre y forman el lla-
mado “complejo tuberculosis”. M leprae, es el causante de la lepra
y las micobacterias atípicas, son micobacterias distintas de las ante-
riores, algunas de las cuales, son capaces de producir enfermedades
en el hombre (2). Estos microorganismos producen una importante
morbilidad en humanos, incluyendo infecciones de tipo pulmonar,
en la piel y tejidos blandos y enfermedad diseminada. El diagnóstico
rápido y preciso de infecciones micobacterianas es de gran impor-
tancia debido al hecho de que un tratamiento antibiótico inapropia-
do puede conducir a la resistencia a los fármacos o la exposición in-
necesaria a toxicidad de los medicamentos. La identificación precisa
en el laboratorio de microbiología es un reto dado que las pruebas
bioquímicas son lentas e incapaces de identificar las especies menos
comunes, las sondas moleculares disponibles identifican un número
limitado de especies, y la secuenciación genómica es técnicamente
compleja y de alto coste económico.
La espectrometría de masas MALDITOF MS (Matrix-Assisted
Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry) es
una potente herramienta para la identificación de bacterias y levadu-
ras en el laboratorio clínico. Esta técnica permite la identificación de
microorganismos mediante el análisis del perfil o espectro proteómi-
co obtenido tras el procesamiento de la muestra permitiendo lograr
una identificación rápida y precisa de todas las especies de micobac-
terias (3, 4). Los primeros avances en la identificación de micobacte-
riasmediante la técnicaMALDI-TOF datan aproximadamente del año
1996, cuando Claydon et al. (5) detectaron algunos espectros en una
cepa de M. smegmatis. Posteriormente, en el año 2006, Pignone et
al. (6) afirmaron que el MALDI-TOF puede servir como sistema de
identificación para micobacterias. Desde entonces numerosas publi-
caciones (7, 8, 9) han tratado de evaluar la utilidad del MALDI-TOF en
la identificación de micobacterias. Recientemente El khechine et al.
(2011) (10) y Saleeb et al. (2011) (11) han aportado diversas formas
de optimizar el procedimiento de extracción para la identificación de
micobacterias. Todos los resultados de estos estudios se desarrolla-
ron mediante la elaboración de su propia base de datos.
En este trabajo valoramos la utilidad de MALDITOF MS en el
diagnóstico etiológico de infecciones (12, 13, 14) causadas por mi-
cobacterias dado que es un método relativamente simple, rápido, y
asociado unmenor coste de consumibles que la identificaciónmicro-
biológica tradicional (15, 16).
MATERIAL Y MÉTODOS
La población de estudio de nuestro trabajo fueron 75 aislados
de micobacterias procedentes de cultivo en medio sólido Lowens-
tein-Jensen (incubación a 37ºC en atmósfera aerobia, con un tiempo
medio de 21 días con el objetivo de obtener una cantidad suficiente
de colonias para su identificación). Todos los aislados pertenecen a
muestras clínicas y todas las cepas fueron trabajadas siguiendo las
condiciones de bioseguridad clase 3. Estas cepas fueron catalogadas
como
Mycobacterium tuberculosis
complex (n=50),
Mycobacterium
avium
(n=10) y otras 15 micobacterias atípicas (4 cepas de
Myco-
bacterium kansasii
, 3 cepas de
Mycobacterium chelonae
, 4 cepas
de
Mycobacterium gordonae
, 3 de
Mycobacterium fortuitum
, y una
cepa de
Mycobacterium marinum
). El diagnóstico fue realizado me-
diante técnicas moleculares de PCR e hibridación inversa: GenoType
Mycobacterium CM y GenoType Mycobacterium AS.
De forma paralela, las cepas fueron sometidas a un proceso
de inactivación para su identificación mediante MALDITOF MS, si-
guiendo un protocolo que incluye un pretratamiento de las mues-
tras para degradar la micobacteria y posterior extracción mediante
acetonitrilo y ácido fórmico, obteniéndose un 1 μl del sobrenadante
y depositándolo en la placa del espectrómetro junto a 1 μl de matriz.
*Protocolo:
1. Añadir 300 μl de agua (grado HPLC) en tubo tipo Eppendorf.
2. Transferir suficiente cantidad demicobacteria al tubo evitan-
do coger medio, para obtener aproximadamente 105 CFU/mL.
3. Inactivación durante 30 minutos a 100°C (95°C en un baño
seco).
4. Mezclar muy bien y añadir 900 μl Etanol 100%. Mezclar muy
bien usando vortex.
5. Centrifugar amáxima velocidad (13.000 - 15.000 rpm) 2min.
Eliminar el sobrenadante.
6. Añadir 500 μl agua y resuspender muy bien el sedimento.
7. Centrifugar a maxima velocidad durante 2 minutos, eliminar
el sobrenadante (utilizando puntas de pipeta).
8. Añadir 50 μl de agua y resuspender muy bien el sedimento.
9. Dejar enfriar la muestra y añadir 1200 μl (e.g. 2 x 600 μl)
de alcohol puro previamente congelado (almacenar en congelador,
-18°C / -20°C).
10. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos y eli-
minar el sobrenadante. Si fuera necesario centrifugar de nuevo y
eliminar con cuidado el resto de etanol, utilizando puntas de pipeta.
11. Añadir Acetonitrilo puro (10 μl hasta 50 μl, dependiendo
del tamaño del sedimento) y mezclar muy bien mediante vortex o
con pipeta.
12. Añadir las bolitas de sílice (0.5 mm Zirconia / Silica beads, la
cantidad será el equivalente a la punta de una espátula).
13. Agitar con vortex a máxima velocidad durante 1 minuto.
14. Añadir Ácido Fórmico 70% (mismo volumen que acetonitri-
lo) y mezclar con vortex.
15. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos.
16. Coger 1 μl del sobrenadante y depositarlo en la tarjeta
MALDI. Dejar secar.
17. Añadir 1 μl de la solución de matriz y dejar secar comple-
tamente.
*Lectura de lasmuestras: El análisis de proteínas se lleva a cabo
con el espectrómetro demasas MALDI Microflex LT (Bruker Daltonic)
con el software FLexControl (versión 3.0). Para identificar los espec-
tros obtenidos en cada aislado clínico se utilizó la librería demicobac-
terias V 1.0 de Malditof Biotyper (173 MSPs).
El espectro es obtenido en modo positivo lineal (frecuencia del
láser N2: 60Hz, voltaje de la fuente de iones I: 20 KV, voltaje de la fuen-
te de iones II: 16,7 KV; rango de masas del detector: 2000 – 20000 Da.
La huella peptídica obtenida de cada microorganismo es comparada
con las huellas de microorganismos conocidos presentes en la base
de datos del fabricante. De tal forma que la huella problema se puede
asociar estadísticamente, mediante el programa Maldi Biotyper 3.0,
con la huella más semejante y realizar así la identificación del microor-
ganismo. [14,15] 10 El software proporciona un score de fiabilidad de
identificación del microorganismo. Las puntuaciones de 2.300 a 3.000
significan una alta probabilidad de identificación a nivel de especie. De
2.000 a 2.299, identificación segura a nivel de género y probable a ni-
vel de especie. De 1.700 a 1.999, identificación probable de género. De
menos de 1.699, identificación no fiable.