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González- Andrades, M.
Modelo in vivo de lesión corneal
INTRODUCCIÓN:
Las enfermedades que afectan a la córnea son una de las prin-
cipales causas de ceguera en el mundo, situándose entre las tres más
prevalentes a nivel mundial (1). Actualmente los únicos tratamientos
disponibles son la queratoplastia o trasplante de córnea mediante
un injerto de donante, y la queratoprótesis (2). El acceso a ambos
tratamientos en los países donde más se precisan es muy limitado
por la falta de donantes y medios sanitarios (3). Además, en relación
con el trasplante de córnea, existe una baja supervivencia del injerto.
Esto se debe a la alta probabilidad de rechazo inmunológico asociada
a la neovascularizacion e insuficiencia limbar que presentan la mayo-
ría de los pacientes con ceguera corneal (4).
En relación a este contexto, la Ingeniería Tisular emerge con
el objetivo de dar respuesta a la ausencia de una terapia eficaz para
estos pacientes mediante la creación de tejidos artificiales que reem-
placen la córnea dañada del paciente. Existenmúltiples propuestas de
sustitutos para la córnea, realizadas a partir de diversos biomateria-
les como la fibrina (5), la fibrina agarosa (6), el colágeno (7), la seda
(8), o las córneas descelularizadas (9). Los sustitutos corneales han de
biointegrarse con la zona dañada de la córnea nativa del paciente para
conseguir una unión perfecta con el tejido receptor. Dicha región, se
caracteriza generalmente por una reacción de fibrosis donde los que-
ratocitos cambian su fenotipo para convertirse en fibroblastos cornea-
les o enmiofibroblastos (10). De estemodo, se hace necesario realizar
una evaluación óptima en la fase preclínica de la integración de las
córneas artificiales en un órgano previamente dañado.
La evaluación de un sustituto corneal sobre una córnea previa-
mente dañada se puede realizar usando modelos lesionales previa-
mente caracterizados. Idealmente, dichos modelos han de mimetizar
las condiciones patológicas que se encuentran en las córneas de los
pacientes que precisan estos tratamientos, como son: la desestruc-
turación del estroma corneal asociando una reacción de fibrosis, así
como una pérdida de transparencia. Hasta la fecha, sólo se han descri-
tomodelos lesionales corneales in vivo basados lamayoría en quema-
duras alcalinas infligidas sobre animales de experimentación (11,12).
Ante los inconvenientes tanto éticos como materiales que sub-
yacen al uso de modelos in vivo, es preciso encontrar nuevos mo-
delos lesionales corneales que puedan emplearse en el laboratorio
sin la necesidad de usar animales de experimentación. El objetivo de
nuestro estudio es generar y caracterizar un modelo lesional corneal
ex vivo para la evaluación de tejidos artificiales creados por Ingenie-
ría Tisular mediante la aplicación de una quemadura caústica sobre
córneas porcinas.
MATERIAL Y MÉTODOS:
Obtención de córneas y proceso de causticación:
Se obtuvieron 18 ojos de cerdos adultos de un matadero lo-
cal, inmediatamente después de su muerte. Tras ello, se realizó un
proceso de causticación con NaOH 1,5 M a tiempos crecientes (1,
2, 3 y 5 minutos) sobre los globos oculares completos (n=3). A con-
tinuación, se realizó un lavado con agua corriente continua durante
5 minutos, seguido de una inmersión rápida en PBS, para continuar
con un nuevo lavado en PBS de 2 minutos. Posteriormente, se trepa-
naron los 8mm centrales corneales usando un punch de 8mm (Inte-
gra® Miltex®) para su evaluación histológica. Se incluyeron dos gru-
pos control para su comparación con los anteriores (n=3): córneas no
tratadas, trepanadas directamente tras la extracción del globo ocular
y córneas sólo tratadas con los lavados de agua corriente y PBS sin
inmersión en NaOH.
Evaluación histológica:
Las muestras fueron fijadas en formaldehído al 4%, se deshidra-
taron en una serie de etanol, tras lo cual se incluyeron en parafina.
Las secciones transversales fueron cortadas, a 5 micras de espesor, se
tiñeron con tinciones de: Hematoxilina y Eosina (HE), PicroSirius y Azul
Alcian. En primer lugar, la parafina fue retirada de los cortes de tejido
empleando xileno. Posteriormente la muestra se rehidrató con agua a
través de una serie decreciente de alcoholes (100%, 96%, 70%, 50%, y
agua). Tras este proceso se realizaron las diferentes tinciones.
Para evaluar el patrón de tejido con el fin de reconocer los nú-
cleos de las células, el material citoplásmico, la membrana celular
y algunas estructuras extracelulares, se realizó una tinción con HE.
Para evaluar la presencia de fibras de colágeno, el componente ma-
yoritario del estroma corneal, se realizó tinción Picrosirius Red usan-
do solución Sirius F3B roja durante 30 minutos, que se contrastó con
hematoxilina de Harris durante 5 minutos, usando para su visualiza-
ción microscopía de luz polarizada. Para determinar el contenido de
proteoglicanos, componente fundamental para la organización ca-
racterística de las fibras de colágeno en el estroma corneal, las mues-
tras se incubaron en solución de azul Alcian durante 30 minutos y se
contrastaron con solución de rojo nuclear rápido durante 1 minuto.
Las imágenes histológicas se tomaron con unmicroscopio óptico
empleando las mismas condiciones para todos los grupos (tiempo de
exposición, balance de blancos, fondo, etc.) a diferentes aumentos (4x,
10x y 20x). Posteriormente, para cuantificar los daños producidos en el
tejido corneal, lasmuestras se analizaron cuantitativamente utilizando
el software de análisis de imagen ImageJ. Se analizaron de forma inde-
pendiente tres regiones diferentes del estroma corneal de cada mues-
tra, correspondiente a la región anterior, la región media y la región
posterior de cada córnea, tomando para ello una selección rectangular
del mismo área para las tres regiones analizadas.
Para cuantificar la intensidad de la tinción específica de cada
componente de la matriz extracelular (ECM), tanto de las muestras
como de los controles, se usó el software de análisis de imagen Ima-
geJ. Con cada una de las regiones seleccionadas (anterior, media y
posterior) de las imágenes captadas con el aumento de 10x, se llevó
a cabo el mismo procedimiento: se seleccionó el color de interés que
deseábamos analizar (para seleccionar el azul alcian y el rojo picro-
sirius se usó la función Color Function- Color deconvolution, y para
seleccionar el verde se usó la función Color Split Channel), se pasó
la imagen a 8 bits y después se invirtieron los colores de la imagen
mediante el comando Invert. Tras esto, se seleccionó el área rectan-
gular y se cuantificó la intensidad media de los pixels de la imagen
mediante el uso de la función Analyze/Measure del software ImageJ.
Para evaluar el grado de compactación estromal, se tomó en
cuenta el grado de separación de las fibras colágenas en la tinción
de Picrosirius. Todo ello se calculó mediante el programa ImageJ,
tras seleccionar las regiones anterior, media y posterior. Para ello, se
seleccionó el canal rojo y se convirtió la imagen a binario, se invirtie-
ron los canales y se analizó posteriormente mediante un histograma
la cantidad de pixels de intensidad 0 (color máximo negro, corres-
pondiente al colágeno) y de intensidad 255 (color máximo blanco,
correspondiente al espacio vacío entre fibras). El grado de separa-
ción de las fibras colágenas se calculó dividiendo el número de pixels
blancos entre los pixels negros.
Análisis estadístico:
El análisis estádistico se realizó usando ANOVA con normaliza-
ción de Bonferroni para el análisis de las diferencias entre los diferen-
tes grupos para cada región corneal evaluada. Para la comparación
entre los dos grupos controles utilizados en el estudio, se realizó la
prueba T-Test. Para la evaluación entre las regiones dentro de cada
grupo, se usó T-Test con corrección de Bonferroni. Para el análisis es-
tadísticos ANOVA, se usó el software estadístico Stata/SE 12.0. Para
el resto de análisis, se empleó el software Excel 2010. p<0.05 se con-
sideró como significativo en todos los tests realizados.
RESULTADOS:
Evaluación histológica
La tinción con HE (Figura 1) mostró la ausencia de epitelio y en-
dotelio corneal en los cuatro grupos tratados con NaOH. No se obser-
varon alteraciones evidentes, tanto a nivel estromal entre las mues-
tras tratadas con NaOH y los controles, siendo el componente celular
como extracelular similares entre los grupos.