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Ana Fernández González
Estudio piloto de tolerabilidad cutánea de láminas de fibrina-agarosa
INTRODUCCIÓN
La generación en el laboratorio de sustitutos tisulares que
reproduzcan la estructura y la histología del tejido nativo hace
necesario combinar el componente celular con biomateriales. Los
biomateriales pueden ser de origen natural o sintético y su función
es sustituir la matriz extracelular del tejido a reparar.
En ingeniería de tejidos (1)(2), es de vital importancia que el
biomaterial permita la proliferación del componente celular en su
interior y/o en su superficie. La elección del biomaterial óptimo
está fuertemente condicionada al cumplimiento de unos estrictos
controles de calidad indicados a continuación:
• Biocompatible: el biomaterial debe integrarse en el in-
dividuo receptor sin provocar daños o reacciones adver-
sas.
• Biodegradable: el biomaterial debe ser químicamente
estable o inerte.
• No tóxico: el biomaterial debe presentar ausencia de to-
xicidad o efectos secundarios.
• Resistente: el biomaterial debe cumplir los requerimien-
tos biomecánicos establecidos para desarrollar correc-
tamente su función en el individuo receptor; adecuada
resistencia mecánica, elasticidad, etcétera.
• Fácilmente reproducible: el diseño, el tamaño y la forma
deben ser los adecuados.
La utilización de biomateriales naturales representa la mejor
alternativa como base para el diseño de sustitutos tridimensiona-
les con fines terapéuticos, tanto en ingeniería de tejidos como en
cirugía reconstructiva. Este tipo de productos se caracteriza por po-
seer propiedades físicas y químicas que se asemejan al tejido nati-
vo y han sido ampliamente utilizados en el desarrollo de sustitutos
de piel. Para generar un modelo de piel humana artificial (3)(4)(5),
es necesario desarrollar un sustituto de estroma dérmico con fi-
broblastos humanos inmersos en su interior (6) y posteriormente,
cultivar los queratinocitos en la parte superior (7)(8).
El polímero natural más utilizado es el colágeno (9–11), com-
ponente mayoritario del tejido conjuntivo. El colágeno se carac-
teriza por poseer elevada fuerza tensil (12), promover la formación
de agregados, retener el agua y facilitar la formación de geles.
Además, biológicamente, favorece la adhesión celular, interaccio-
na con plaquetas y produce la activación de los componentes del
sistema de coagulación sanguínea (13).
Los derivados sanguíneos (14), se presentan como el bioma-
terial biológico idóneo para formar parte de la composición del an-
damiaje, por su facilidad de obtención y la posibilidad de obtener
equivalentes autólogos (15). La fibrina utilizada como biomaterial
tiene propiedades similares al colágeno (16). En condiciones fi-
siológicas, la reparación tisular de un tejido dañado se inicia con
la formación de una compleja red proteica a base de fibrina en la
zona afectada. Los sustitutos de fibrina (17) se caracterizan por pro-
mover la proliferación y la adhesión celular y facilitar la correcta
distribución de las células en la estructura tridimensional (18)(19).
Aunque la utilización de la fibrina como biomaterial supuso
un gran avance, la adaptación clínica de este tipo de sustitutos
presenta limitaciones basadas en su escasa consistencia y resistencia
que dificulta su manipulación e implante. Por esta razón, se hace
necesario combinar la fibrina con algún polisacárido que aporte
consistencia y resistencia al sustituto tisular. Uno de los sustitutos
de tejido más consistentes es aquel que combina el uso de fibrina
con la agarosa tipo VII. La agarosa es un polisacárido formado por
galactosas alfa y beta que se extrae de algas de los géneros
Gellidium
y
Gracillaria
. Por lo tanto, la agarosa es un producto natural que
facilita la formación de una matriz inerte y no tóxica.
Hasta el momento, la combinación de fibrina-agarosa como
biomaterial ha sido utilizada para el desarrollo de un modelo tridi-
mensional de córnea (20)(21)(22)(23), de mucosa oral (24)(25)(26)
(27)(28), de cartílago (29) y más recientemente de piel (30).
La limitación con la que nos hemos encontrado en el proceso
de traslación a clínica humana de este modelo de piel humana
creada por ingeniería de tejidos, es que un sustituto que contenga
en su composición fibrina-agarosa nunca ha sido aplicado tópica-
mente en humanos. Por esta razón, el objetivo de este trabajo es
comprobar que no existen reacciones adversas de tipo irritativo o
alérgico al implantar tópicamente láminas de fibrina-agarosa en
voluntarios sanos, poniendo de manifiesto la tolerabilidad cutánea
de esta combinación de biomateriales.
METODOLOGÍA
1. Elaboración de las láminas de fibrina-agarosa sin células
Las láminas de fibrina-agarosa sin células se elaboraron en
el laboratorio de control de calidad de la Unidad de Producción
Celular e Ingeniería Tisular del Complejo Hospitalario Universita-
rio de Granada utilizando placas de cultivo de 144 cm
2
(Greiner
bio-one Hungary Kft., Hungría). Las láminas se generaron usan-
do una mezcla de fibrina humana a partir de plasma congelado
AB+ y 0,1% de agarosa de tipo VII (Sigma) en agua destilada. Para
establecer el estroma dérmico, se añadieron 41,6 ml de plasma
humano a 3,35 ml de medio de cultivo específico para fibroblas-
tos dérmicos (MF). La mezcla se suplementó con 830 μl de ácido
tranexámico (Amchafibrin, Rottapham, España) para prevenir la
fibrinólisis. Para inducir la polimerización de fibrina se añadieron
1 ml de CaCl
2
(Braun Medical, España 10 mg / ml) y 720 µl de agua
estéril (Fresenius Kabi), seguido de la adición inmediata de 2,5 ml
de agarosa concentrada (2,2% en agua destilada) fundida a 37 –
38°C. La concentración final de agarosa en el estroma dérmico
fue 0,1%. Finalmente, los 50 ml de mezcla se añadieron en las
placas de cultivo de 144 cm
2
y se dejaron solidificar a 37°C du-
rante 2 horas (Figura 1-A). Después de dos horas, se añadieron
25 ml de MF.
Las láminas de fibrina-agarosa se mantuvieron durante un día
a 37°C con 5% de CO
2
.
2. Nanoestructuración de las láminas de fibrina-agarosa sin
células
Un día después del proceso de fabricación, las láminas de
fibrina-agarosa se despegaron de la placa de cultivo, para promo-
ver su deshidratación mediante el proceso de nanoestructuración
(Figura 1-B).
El proceso de nanoestructuración consistió en colocar la
lámina de fibrina-agarosa sobre una superficie de nanoestructura-
ción inferior compuesta por papel absorbente (Thermo Scientific) y
malla de 100 µm (Millipore) y 11 µm (Millipore). En la parte supe-
rior de la lámina fibrina-agarosa se colocó un tul, y sobre el tul, la
superficie de nanoestructuración superior compuesta por malla de
11 µm y 100 µm y papel absorbente. Durante un tiempo concreto
se colocó un peso de 300 g en la superficie de nanoestructuración
para provocar el alineamiento de las fibras del estroma dérmico y
la pérdida de grosor de la lámina.
3. Colocación de las láminas de fibrina-agarosa sin células en
voluntarios sanos
Para realizar la colocación en los voluntarios sanos, las lá-
minas de fibrina-agarosa se dividieron en fragmentos de 4 cm
2
. A
cada voluntario se le implantaron dos fragmentos en el antebrazo
izquierdo (Figura 1-C). Ambas láminas (Figura 1-D) se cubrieron con
un apósito impregnado (Linitul ®) y una de las láminas (Figura 1-E)
se cubrió con pomada antibiótica (Mupirocina 20 mg/g, Isdin ®).
Finalmente, las dos láminas implantadas en el antebrazo se cubrie-
ron con un apósito protector (Figura 1-F). Todos los voluntarios fue-
ron informados sobre los posibles efectos secundarios asociados
con la colocación de la lámina así como del protocolo de seguimien-
to del estudio.