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Boris Damian Jaimes Parra
Evaluación microscópica de la transdiferenciación de las células madre.
segmentos de tejidos gastrointestinales, ya sea para el reempla-
zo o la reparación de la vejiga (1-3). La utilización de implantes
de tejidos gastrointestinales en el sistema urinario disminuye sin
embargo la tolerancia de estos tejidos al contacto con la orina y
produce graves riesgos tales como producción excesiva de moco,
urolitiasis, trastornos metabólicos y malignización (1-3). De este
modo, la ingeniería tisular se presenta como una alternativa via-
ble y prometedora en el tratamiento de pacientes que requieran
reemplazo o reparación de la vejiga urinaria. La mayoría de los
sustitutos vesicales desarrollados hasta el momento se basan en
la utilización de cultivos autólogos de células uroteliales (1). En
este sentido, se ha descrito, la escasa capacidad proliferativa de
estas células in vitro, lo cual dificulta la creación de tejidos arti-
ficiales vesicales. En este contexto, las células madre mesenqui-
males de la gelatina de Wharton (HWJSC) podrían representar
una fuente alternativa para la construcción de estos tejidos. Las
propiedades inmunomoduladoras (4-6), su capacidad de transdi-
ferenciación en los tres linajes embrionarios (7-11), así como su
alta tasa de expansión, convierten a esta estirpe celular en una
fuente de células madre idónea para su utilización en protocolos
de ingeniería tisular, como se ha demostrado en la construcción
de distintos tejidos como son córnea y piel (7-8, 10). El presente
trabajo tiene por objeto el estudio de los cambios morfológicos
que presentan las HWJSC inducidas hacia urotelio, utilizando un
nuevo medio condicionado.
MATERIAL Y MÉTODOS
Obtención de cultivos primarios de células uroteliales y cé-
lulas madre de la gelatina de Wharton.
En primer lugar, para la generación de cultivos prima-
rios de células uroteliales de la vejiga humana, se utilizó la técnica
de explante a partir de pequeños fragmentos de vejiga, de acuer-
do con los protocolos establecidos al respecto. Una vez obtenidos
los fragmentos de tejido vesical, las células uroteliales se culti-
varon en frascos de cultivo de 25 cm2 con medio de cultivo (QC)
durante 7 y 14 días. El medio de cultivo QC estaba constituido
por HAM-F12: 150 ml; DMEM: 300 ml; suero bovino fetal: 50 ml;
penicilina-estreptomicina: 50 UI/ml; adenina: 24 µg/ml; insulina:
5 µg/ml; triyodotironina: 1.3 ng/ml; toxina colérica: 8.3 ng/ml;
hidrocortisona: 0.4 µg/ml; factor de crecimiento epidérmico: 10
ng/ml. En el caso de los cultivos primarios de células de HWJSC,
se obtuvieron pequeños fragmentos de cordón umbilical y se so-
metieron a digestión enzimática con colagenasa tipo I (Gibco BRL
Life Technologies) y tripsina 0,5 g / L-etilendiaminotetraacético
ácido solución de 0,2 g / l (EDTA) (Gibco BRL). Las células disgrega-
das se mantuvieron en medio de cultivo Amniomax
®
(Gibco BRL)
bajo condiciones de cultivo estándar durante 7 y 14 dias (7).
Inducción de cambios morfológicos de tipo urotelial en cé-
lulas HWJSC.
Para llevar a cabo el proceso de inducción de las HWJSC,
se utilizó medio condicionado (MC) obtenido a partir de cultivos
primarios de células uroteliales. Para la obtención del MC fue ne-
cesario mantener las células uroteliales en medio de cultivo QC
durante nueve días. Posteriormente, el medio QC fue obtenido,
filtrado, y suplementado con 10% de suero bovino fetal (SBF),
0,1% factor de crecimiento epidermal (EGF) y 1% de antibióticos,
pasando a denominarse MC. El proceso de cambio en la mor-
fología de las HWJSC hacia urotelio se realizó utilizando 20.000
HWJSC, las cuales se cultivaron en MC durante 7 y 14 días. Como
control, se utilizaron 20.000 HWJSC cultivadas en medio Amnio-
max
®
(Gibco BRL) con el objeto de mantener el perfil de indiferen-
ciación de dichas células.
Evaluación microscópica del proceso de transdiferenciación
urotelial de las HWJSC.
En el presente trabajo, se realizo una evaluación micros-
cópica de las células uroteliales cultivadas en medio QC, así como
de las HWJSC cultivadas en medio Amniomax
®
y las cultivadas con
MC durante 7 y 14 días. Para la evaluación microscópica, se utilizó
un microscopio Nikon eclipse Ti-U, con el cual se tomaron imá-
genes con aumento de 10X de todos los cultivos celulares. Pos-
teriormente, todas las imágenes fueron procesadas y analizadas
utilizando el software ImageJ 1.48v. En primer lugar, se calculó el
porcentaje de confluencia en dos imágenes correspondientes a
cada grupo de estudio: urotelio cultivado con QC, HWJSC cultiva-
do con MC y de control las HWJSC cultivado con Amniomax
®
. En
segundo lugar, se calculó el diámetro celular en las dos dimen-
siones (largo y ancho) de 20 células correspondientes a cada uno
los grupos experimentales. El análisis se llevó a cabo calculando
el valor promedio y la desviación estándar de cada grupo. En este
sentido, la evaluación de la capacidad de transdiferenciación de
las HWJSC hacia urotelio se analizó mediante la identificación de
cambios morfológicos utilizando los datos previamente descritos.
RESULTADOS
Obtención de cultivos primarios de células uroteliales y célu-
las madre de la Gelatina de Wharton.
Tras la obtención de las biopsias de vejiga humana, se
lograron obtener cultivos primarios correspondientes a la capa mu-
cosa, concretamente, de células uroteliales. Como primeros hallaz-
gos encontramos que los cultivos primarios de células uroteliales
presentaban una confluencia del 75% a los 7 días y mayor del 90%
a los 14 días de cultivo, cuyo crecimiento era en colonias (Figuras
1A y 1B). Además, como se observa en la Figura 1C, las células uro-
teliales crecieron alrededor del explante, tomando una morfología
poligonal que les da la característica forma de “adoquines” cuyas
dimensiones fueron 6,614±1,049 x 3,966±1,051 µm a los 7 días y
5,293±1,011 x 4,057±1,300 µm a los 14 días. Como segundo hallaz-
go, encontramos que las HWJSC cultivadas en medio Amniomax®,
utilizadas como control en este trabajo, presentaron una confluen-
cia del 85% a los 7 días y mayor del 90% a los 14 días. También se
observó una rápida capacidad de proliferación in vitro. El análisis
morfológico reveló que a los 7 y 14 días presentaban morfolo-
gía fusiforme (Figuras 2A y 2B) cuyas dimensiones fueron 9,046±
2,831 x 1,868±0,685 µm a los 7 días postcultivo y 9,172±2,006 x
1,568±0,566 µm a los 14 días, a diferencia de la morfología de las
células uroteliales.
Figuras 1A. Células uroteliales cultivadas con medio QC a los 7
días. 1B Células uroteliales cultivadas con medio QC a los 14 días.
Figura 1C. Células uroteliales cultivadas con medio QC presentando
crecimiento alrededor del explante. (Flechas negras).