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Álvaro Sierra-Sánchez
Caracterización celular y estudio de expresión de HLA I y II en células mesenquimales troncales humanas diferenciadas in vitro
Las hCMTs se caracterizaron también mediante un análisis
por citometría de flujo (CMF), con el cual se comprobó la expre-
sión de marcadores requeridos por la Sociedad Internacional de
Terapia Celular y la ausencia de expresión de los marcadores HLA
de clase I y clase II (
Tabla 1
)
.
3.2. Estudio de diferenciación in vitro de las hCMTs a células
de linaje epitelial
Las hCMTs se diferenciaron y mantuvieron durante 3 sema-
nas las de TA y durante 3 y 4 semanas las de MO, al observarse un
proceso de diferenciación más lento. Tras ese período, se recupera-
ron y prepararon para su análisis histológico, inmunohistoquímico
y fenotípico.
El análisis realizado demostró indicios de diferenciación de las
hCMTs a células de linaje epitelial. Desde el punto de vista histoló-
gico, la tinción de H&E determinó el cambio de morfología celu-
lar con presencia de células de aspecto epitelioide, similares a los
queratinocitos de la piel o las células limbares de la córnea. En el
estudio inmunohistoquímico, el análisis de los marcadores de cito-
queratinas (CK5, 6 y 14) y filamentos intermedios (vimentina), re-
veló una menor diferenciación de las hCMTs deMO a las 3 semanas
(
Figura 3
), debido a la expresión mínima de estos marcadores. En
el caso de las hCMTs de TA y MO diferenciadas a las 3 y 4 semanas
respectivamente (
Figura 4
), se observó un leve incremento de la
expresión de los marcadores.
El análisis por citometría de flujo del panel de marcadores
definido mostró (
Tabla 2
) una pérdida significativa de expresión de
CD73 y CD105, sobre todo a las 3 semanas de diferenciación de las
de origen de TA y a las 4 de las de MO.
3.3. Estudio de expresión de HLA I y II
La expresión de los marcadores de HLA I y II fue negativa en
las células en las que se indujo la diferenciación tanto de origen de
MO como de TA a las 3 y 4 semanas (
Tabla 2
).
Marcador
Criterios
deaceptación
(%células
positivas)
Resultado
HCMTS TA
(%células
positivas)
Resultado
HCMTSMO
(%células
positivas)
cd45
< 20%
0
0
cd19
< 20%
0
0
cd11b
< 20%
0
0
hla-dr
(clase ii)
< 20%
0
0
hla-abc
(clase i)
*sin
determinar
0
0
cd90
>80%
99%
96,9%
cd73
>80%
96%
99,7%
cd105
>80%
95%
99,3%
cd44
>80%
99,5%
99,6%
Tabla 1. Resultados de la Citometría de flujo antes de la diferenciación
delashCMTsdeTAyMOycriteriosdeaceptaciónparaserconsideradas
como células madre. *HLA-ABC no está descrito comomarcador típico
de célulasmadre pero se ha incluido para observar posibles diferencias
tras el proceso de diferenciación.
Tabla2.ResultadosdelaCitometríadeflujodespuésdeladiferenciación
de las hCMTs de TA y MO (3 y 4 semanas).
Figura 3. Imágenes del análisis histológico e inmunohistoquímico
de las hCMTs de MO diferenciadas durante 3 semanas. A) Tinción
con Hematoxilina y Eosina, B) Inmunohistoquímica de CK14, C)
PanCitoqueratina y D) Estudio de vimentina.
Figura 4. Imágenes del análisis histológico e inmunohistoquímico de
las hCMTs de MO diferenciadas durante 4 semanas. Se observaron
similares resultados en las hCMTs de TA diferenciadas durante 3
semanas. A) TinciónconHematoxilinayEosina, B) Inmunohistoquímica
de CK14, C) Pan-Citoqueratina y D) Estudio de vimentina.
Marcador
Resultado
QT DE
HCMTS TA
(% Célula
positivas)
Resultado
QT
DE HCMTS
MO
(% Células
positivas)-3S
Resultado
QT
DE HCMTS
MO
(% Células
positivas)-4S
CD45
0
0
0
CD19
0
0
0
CD11b
0
0
0
HLA-DR
(Clase II)
0
0
0
HLA-ABC
(Clase I)
0
0
0
CD90
93,7%
98%
97,8%
CD73
Expresión
débil
94,3%
33%
CD105
Débil o
negativo
98,1%
25%
CD44
95,1%
97,99%
96,1%