Revista nº 798

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73 Álvaro Sierra-Sánchez
Caracterización celular y estudio de expresión de HLA I y II en células mesenquimales troncales humanas diferenciadas in vitro
Abstract
Background: Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow are one of the most
common cell therapy procedures used in recent clinical trials due to their immunomodulation capacity. Further-
more, for their epithelial differentiation potential can be used in tissue engineering, incorporated in artificial
tissues such as skin and cornea, replacing autologous epithelial cells. It is necessary to make a correct cellular
characterization of differentiated cells and to study the effect in HLA I and II expression.
Objetives:Characterization and quality controls under GMP conditions of in vitro differentiated human mesenchy-
mal stem cells from different sources (adipose tissue and bone marrow) to epithelial lineage, and study of HLA I
and II expression before and after differentiation.
Methods: Isolation and expansion of two human mesenchymal stem cells lines from their tissues of origin and in
vitro differentiation to epithelial cells using culture mediums supplemented with specific growth factors. Quality
controls according Good Manufacturing Practices have been made and HLA I and II expression before and after
differentiation have been studied. Finally, characteristics of differentiated cells have been demonstrated by histo-
logical and immunohistochemical analysis.
Results: Two human mesenchymal stem cells lines from adipose tissue and bone marrow have been isolated
complying with the proposed quality controls. After in vitro differentiation, human mesenchymal stem cells do
not express HLA (I and II) markers, which are important in immune response, but weakly express proteins related
to main epithelial layers of human skin (CK5, CK6 and CK14).
Conclusion: The absence of expression of HLA I and II by flow cytometry in differentiated cells would promote the
use of them with allogenic character to construct human skin and cornea by tissue engineering, however, more
studies and protocols are required to confirm these preliminary results and to optimize in vitro differentiation of
human mesenchymal stem cells.
Biomedicine, Human
Mesenchymal Stem Cells, Cell
Differentiation, HLA Antigens,
Cellular Characterization.
INTRODUCCIÓN
La biomedicina regenerativa es un área multidisciplinar emer-
gente que pretende desarrollar nuevos productos o terapias que
permitan reparar, sustituir o regenerar tejidos y órganos dañados
de pacientes (1). La mayoría de los tratamientos que existen hasta
la fecha tienen limitaciones (2,3), lo que ha puesto de manifiesto
la necesidad de buscar nuevas estrategias, para lo cual se está in-
vestigando con células madre autólogas o alogénicas, de diferen-
tes tipos (4): células madre embrionarias humanas (hESCs), células
madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs), y células madre
adultas (ASCs), donde se incluyen las mesenquimales troncales
(CMTs), las hematopoyéticas y las tejido-específicas.
Debido a los inconvenientes que conlleva el uso de hESCs y
las hiPSCs (5), las ASCs, principalmente las células mesenquimales
troncales (CMTs), se han convertido en la terapia más extendida,
gracias a su rápida disponibilidad y probada seguridad (6). Estas
son células madre multipotentes, que pueden obtenerse de dife-
rentes tejidos como gelatina de Wharton (GW), tejido adiposo (TA)
o médula ósea (MO) (7) y diferenciarse, según las condiciones o
factores del medio de cultivo utilizados, a células mesodérmicas
(8,9), pero también a otros linajes no mesodérmicos (7).
Actualmente, estas células se aplican en campos como el
cáncer, la inmunoterapia, la ingeniería de tejidos y la regeneración
tisular (7), como por ejemplo en piel y córnea (10,11). La
regeneración de tejidos dañados requiere células capaces de
proliferar, diferenciarse y contribuir funcionalmente al proceso
regenerativo (7), por ello, el uso de hCMTs resulta esperanzador
debido a las características que poseen y a su facilidad de obtención.
Tanto la piel como la córnea son dos tejidos constituidos
por varias capas de células, donde la más externa sirve de barrera
protectora y está constituida por células epiteliales, queratinocitos
en el caso de la piel y células epiteliales limbares en el de la córnea,
por lo que resulta fundamental el estudio de diferenciación de
hCMTs a células de linaje epitelial.
Para que las hCMTs puedan utilizarse como medicamento
o como parte de estas terapias clínicas, su producción debe
desarrollarse dentro de salas blancas o de GMP (Good
Manufacturing Practices), las células deben de caracterizarse de
forma adecuada y someterse a múltiples controles de calidad como
análisis de viabilidad celular, esterilidad, análisis de micoplasmas,
endotoxinas y cariotipo.
La International Society of Cellular Therapy (ISCT) ha esta-
blecido los criterios (12) que deben de cumplir las hCMTs para
su correcta caracterización y que puedan ser aprobadas como
terapias avanzadas: capacidad de adherencia a plástico, la capa-
cidad de diferenciación a adipocitos y osteocitos, la expresión
de una serie de marcadores de superficie celular (CD90, CD73,
CD105 y CD44) y la no expresión de otros (CD45, CD19, CD11b
y HLA-DR) (13).
Dentro de estos marcadores, destacan los relacionados
con el sistema HLA, un grupo de genes polimórficos que codifi-
can para tres glicoproteínas: I, II y III, importantes en las funcio-
nes inmunológicas (14). Los HLA de clase I (A, B y C), se expre-
san en casi todas las células nucleadas y plaquetas y presentan
péptidos intracelulares a células T citotóxicas (15), mientras que
los de clase II (DR, DQ y DP) se encuentran exclusivamente en
células del sistema inmune, presentando péptidos exógenos a
células T helper (16).
La baja expresión de marcadores HLA tipo I y II y la ausen-
cia de algunas moléculas co-estimuladoras como CD80, CD86 y
CD40 ha favorecido su uso alogénico en diferentes patologías
por su baja inmunogenicidad. Sin embargo, existe cierta con-
troversia en la literatura sobre si el proceso de diferenciación
a otras estirpes celulares favorece la expresión de marcadores
HLA (15-20).
El objetivo de este estudio es aislar y caracterizar dos lí-
neas celulares de hCMTs de distintos orígenes (TA y MO) con
la realización de todos los controles de calidad GMP y en una
segunda fase inducir la diferenciación epitelial in vitro mediante
su cultivo con medios específicos y analizar la posible variación
en la expresión de marcadores HLA clase I y II mediante citome-
tría de flujo.
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Caracterización y control de calidad de las Células Me-
senquimales Troncales Humanas (hCMTs)
Se ha trabajado con dos líneas celulares de hCMTs, una deri-
vada de tejido adiposo (TA) procedente de excedentes de muestras
de la Unidad de Producción Celular e Ingeniería Tisular (UPCIT) del
Complejo Hospitalario Universitario de Granada, y otra derivada de
médula ósea (MO), procedente de excedentes de muestras de con-
trol de calidad que son enviadas a la UPCIT de Granada; previamen-
te los donantes firman el consentimiento informado autorizando el
uso en investigación de las células. Ambas líneas se aislaron y culti-
varon en medio de células mesenquimales troncales (MCMT) (17),
realizando pases celulares hasta conseguir 12 millones de células
necesarias para el estudio de diferenciación.