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Álvaro Sierra-Sánchez
Caracterización celular y estudio de expresión de HLA I y II en células mesenquimales troncales humanas diferenciadas in vitro
2.1.1. Viabilidad y cuantificación celular
Cuando las hCMTs alcanzan una confluencia cercana
al 100%, se retira el medio de cultivo y se lavan con PBS (1
mL/25cm
2
). Posteriormente, se incuban con TrypLE Select 1x
(1 mL/25cm
2
) 5 minutos a 37ºC, 5% CO
2
y 80% de humedad
relativa, tras lo cual, se neutraliza con el doble de volumen de
medio de cultivo. Se recogen las células en tubos de 50 mL y
se centrifugan 10 minutos
a 1500 rpm. Se retira el sobrena-
dante y se resuspende en el medio de cultivo correspondiente.
Finalmente, en un eppendorf de 0,2, se diluyen las hCMTs en
Trypan Blue a una proporción 1:10 (v/v), y se cargan por capi-
laridad en una cámara de Neubauer. que permite, con ayuda
del microscopio, realizar el recuento celular.
2.1.2. Esterilidad
La esterilidad se estudia utilizando el sistema BacT/ALERT
®
3D, para lo cual, al realizar un cambio de medio o pase celular
dentro de la CFL, se recoge el medio en el que se encontraban
las hCMTs, incubándose 1 mL en cada uno de los frascos co-
merciales de análisis de microorganismos anaerobios y aero-
bios. Estos, por su composición, permiten el crecimiento de un
tipo de microorganismo, y gracias al carbón activo, neutralizan
el efecto de los antibióticos que pueda haber en el medio, evi-
tando falsos negativos.
Las muestras se mantienen 7 días en incubación, contro-
ladas por el sistema cada 10 minutos, período tras el cual, si
no se observa ningún cambio colorimétrico, se aseguran las
condiciones de esterilidad.
2.1.3. Análisis de Micoplasmas
En la detección por PCR del ADN de micoplasmas
en el sobrenadante del MCMT, se utiliza el kit comercial
Venor
®
GeM, validado según la Farmacopea Europea, que in-
cluye los controles interno y positivo (ADN de Mycoplasma
orale). Los cebadores del kit son específicos para una región
codificante altamente conservada del ARNr 16S del genoma
de Micoplasma, lo que permite la detección de varias espe-
cies.
En primer lugar, tras reconstituirse los reactivos y con-
servarse según las indicaciones del kit, la muestra de medio
se calienta a 95ºC durante 10 minutos, se centrifuga durante
5 segundos y, se recoge el sobrenadante en un eppendorf es-
téril, descartando el sedimento. Al mismo tiempo, se prepara
la mezcla de reacción de PCR siguiendo las instrucciones del
kit y se reparten 23 µL en cada tubo de reacción, añadiendo 2
µL de muestra, 2 µL de control positivo y 2 µL de agua libre de
DNA (C. Negativo) respectivamente. Estos se introducen en el
termociclador con el siguiente perfil térmico: 1 ciclo a 94ºC
30 segundos, 39 ciclos de tres pasos (94ºC 30 segundos, 55ºC
30 segundos y 72ºC 30 segundos) y mantenimiento a 4ºC.
Una vez terminado el proceso, se le añaden 6 µL de Loading
Dye 5x a cada uno, mezclando bien con pipeta. Finalmente, 5 µL
de cada tubo y del marcador de peso molecular se cargan en los
pocillos del cassette y se corren las muestras en el gel, a 275V
durante 4 minutos con la luz UV encendida y la luz del laboratorio
apagada.
En todos los carriles debe observarse una banda de 191 pb
correspondiente al control interno, mientras que en el carril del
control positivo debe observarse adicionalmente una banda de
267 pb.
2.1.4. Cariotipo
Las hCMTs se siembran en cinco Chamber Slide
®
(3000 célu-
las/cm
2
) con unos 3 mL de MCMT. Se incuban en la estufa a 37ºC,
5% CO
2
, cambiando el medio cada 2-3 días hasta que alcancen
una confluencia del 60-70%. El día antes de proceder a la detec-
ción en metafase, se añaden 120 μL de colcemida (0,4 μg/ml)
,
dejándolos en incubación toda la noche. Al día siguiente se des-
echa el medio, se lavan con 2 mL de KCl 75mM, una solución
hipotónica que provoca la lisis celular y salida de cromosomas,
y se incuban durante 30-35 minutos con 3 mL de KCl 75mM.
Transcurrido ese tiempo se añaden 3 mL de fijador de
Carnoy (metanol y ácido acético glacial en proporción 3:1
(v/v)) y se incuban durante 3 minutos a temperatura ambien-
te (3X). Finalmente, se despegan los portas y se dejan secar,
para posteriormente ser enviados al laboratorio de Citogené-
tica del servicio de Análisis Clínicos del Hospital Universitario
Virgen de las Nieves, donde se obtienen las bandas G me-
diante la tinción de Giemsa.
Para la tinción, se tratan los portas con 2 mL de tripsina
al 0,05% (g/v) en PBS entre 10 y 30 segundos, se lavan con
agua destilada y se tiñen con Giemsa al 5% (v/v) en agua des-
tilada durante 15 minutos. Por último, se lavan con abundan-
te agua y se interpretan los resultados al microscopio.
2.1.5. Diferenciación a adipocitos (ADP) y osteocitos
(OST)
Se siembran 4 T25 (dos controles negativos y dos para
diferenciar) a una densidad de 12.000 cél/cm
2
y 4-5 mL de
MCMT. Se incuban a 37ºC y 5% CO
2
y se cambia de medio
cada 2-3 días hasta que alcancen una confluencia del 85-90%
para comenzar la diferenciación a adipocitos, y del 100% para
la diferenciación a osteocitos.
Los medios de diferenciación utilizados y los protocolos
establecidos tanto para la diferenciación como para la tinción
con Oil Red O y Alizarin Red S, se encontraban previamente
descritos (18)
.
2.1.6. Análisis fenotípico por citometría de flujo (CMF)
Para terminar la caracterización de las hCMTs se utili-
za la CMF, utilizando anticuerpos monoclonales específicos
frente a distintas proteínas de superficie, en este caso CD90,
CD73, CD105 y CD 44 > 80 % y CD45, CD11b y CD19 < 20 %,
además de los HLA de clase I (HLA-A, HLA-B, HLA-C) y el HLA
de clase II (HLA-DR) < 20% (BD Biosciencies, San Jose, CA,
USA). Este panel de anticuerpos monoclonales está estableci-
do por el Servicio de Análisis Clínicos (Sección de Citometría/
Biopatología tumoral) del Hospital Universitario Virgen de las
Nieves, para identificar hCMTs, al cual se le ha incluido el HLA
de clase I.
Se recogen 1 millón de hCMTs/tubo que se centrifugan
30-60 segundos a 8.000-14.000 rpm y resuspenden en 0,5 mL
de PBS. El tubo se envía al Servicio de Análisis Clínicos, que
prepara las siguientes combinaciones de marcadores con 7 μL
de cada anticuerpo:
Tubo 1 (control isotipos): IgG1 PerCP-Cy5, IgG1 PE, IgG1
FITC y IgG1 APC
Tubo 2: CD45-FITC / CD19 PerCP-Cy5 / CD73-PE / CD90-
APC
Tubo 3: HLA-DR-FITC / CD105-PE / CD11b-APC / CD44
PerCP-Cy5
Tubo 4: HLA-ABC-APC
A cada tubo se le añaden 100.000 de hCMTs, se mezclan,
agitando suavemente y se incuban 30 minutos a temperatura
ambiente. Después, se lavan con PBS y centrifugan 5 minutos a
1.500 rpm (2X). Por último, se resuspenden en 0,5 mL de PBS y
se analizan inmediatamente, adquiriendo un mínimo de 5.000
eventos para cada tubo.
Para la interpretación de los resultados se establecen las
ventanas de lectura y con el programa Infinicyt™ se analizan
los histogramas determinando la expresión y porcentajes de cada
uno de los marcadores.