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Álvaro Sierra-Sánchez
Caracterización celular y estudio de expresión de HLA I y II en células mesenquimales troncales humanas diferenciadas in vitro
DISCUSIÓN
La diferenciación
in vitro
de hCMTs de diferentes orígenes
(TA y MO) a células de estirpe epitelial, durante 3 y 4 semanas
es compleja como sugieren estudios previos (10,11). Los análisis
histológicos e inmunohistoquímicos realizados han mostrado
indicios de diferenciación epitelial como el cambio de la mor-
fología celular y la expresión tenue de proteínas específicas ep-
iteliales (10,20,21). El análisis por citometría de flujo de marca-
dores específicos para células mesenquimales ha mostrado la
disminución de la expresión de algunos marcadores como CD73
y CD105 y la ausencia de expresión de los HLA I y II podría tener
interesantes implicaciones en el ámbito de la regeneración tisu-
lar al facilitar el uso de células alogénicas.
La adecuada caracterización celular (26), antes de la
diferenciación, acompañada de sus correspondientes controles
de calidad en el contexto GMP, son requisitos necesarios
imprescindible para asegurar que se está trabajando con hCMTs
útiles para ensayos
in vitro
o
in vivo
.
En este estudio, los controles de calidad de las hCMTs
muestran una viabilidad celular superior al 80% en todo el
proceso de expansión y diferenciación, siendo menor en esta
última etapa debido a que se somete a las células a un cambio
crítico. En cuanto a los estudios de esterilidad y análisis de mico-
plasmas, ambos han resultado negativos, indicativo de que las
condiciones de trabajo y mantenimiento de los cultivos es el ad-
ecuado, evitándose así el crecimiento de microorganismos que
afectarían a los resultados obtenidos. Por último, el cariotipo
normal de ambas líneas, descarta cualquier anomalía genética
del tipo aneuploidía o euploidía, y constituye uno de los con-
troles de calidad necesarios para el trabajo en un entorno GMP,
en futuros estudios será necesario la realización de cariotipos
seriados durante en el proceso de diferenciación celular.
Las hCMTs de TA y MO se adhieren fácilmente a los fra-
scos de cultivo, perdiendo esta capacidad únicamente al final
del proceso de diferenciación a células epiteliales, que no son
capaces de adherirse a plástico (22). Además, las hCMTs se han
diferenciado a adipocitos y osteocitos y el análisis fenotípico ha
mostrado ausencia de expresión de marcadores como CD45,
CD11b y CD19 y relacionados con la respuesta inmune (HLA-DR)
y la expresión de otros marcadores como CD90, CD73, CD105 y
CD44 (13)
.
Las
hCMTs de TA,
han mostrado indicios de diferenciación
epitelial a partir de las 3 semanas tras los análisis histológicos
e inmunohistoquímicos. Estas, han expresado débilmente
proteínas específicas de piel (CK5, 6 y 14), implicadas en procesos
de estabilidad epidérmica debido a su capacidad de unión por
desmosomas y hemidesmosomas (CK5 y 14) y de migración
y reepitelización (CK6) (23); y de de filamentos intermedios
(vimentina) importantes en uniones celulares (desmosomas)
(24); y han dejado de expresar, casi totalmente, los marcadores
CD73 (ecto-5’-nucleotidasa) y CD105 (endoglina), proteínas
implicadas en la proliferación y adhesión celular (25,26).
Las
hCMTs de MO
, han necesitado 4 semanas para mostrar
indicios de diferenciación y la expresión de CD73 y CD105, no
se ha visto tan reducida como en el caso de las células de TA,
lo que sugiere más dificultades para la diferenciación a células
epiteliales.
La inclusión de la caracterización de los HLA de clase I
(HLA-A, HLA-B, HLA-C) y de clase II (HLA-DR), relacionados con
la respuesta inmune, constituye un aspecto interesante de este
trabajo. En las células estudiadas, tanto de TA como de MO, no
se han expresado HLA de clase I y II, ni antes ni después de la di-
ferenciación, lo que favorecería el uso de estas células de origen
alógenico en constructos de piel o córnea creadas por ingenie-
ría de tejidos. Sin embargo, merece la pena destacar que estos
resultados podrían verse modificados dependiendo del estado
de las hCMTs, puesto que según algunos estudios, estas pueden
expresar HLA I (17,27,28) o no (29), lo cual parece que se debe
al número de pases que las células han sufrido antes del análisis
fenotípico, al observarse que a partir de 20 existe una expresión
significativa del mismo (30), indicativo de que las características
de las hCMTs varían con la edad, perdiendo plasticidad celular,
con lo que habría que tenerlo en cuenta en futuros estudios.
Aunque los resultados de este estudio son interesantes,
la optimización del proceso de diferenciación
in vitro
, el uso de
marcadores inmunohistoquímicos más específicos y determinar
si con el tiempo en cultivo las células modifican su perfil de ex-
presión de HLA de clase I son algunas de las limitaciones de este
trabajo.
CONCLUSIONES
La ausencia de expresión de marcadores de HLA tipo I y II
en células hCMTs de TA y MO que han mostrado indicios de dife-
renciación epitelial
in vitro
,
sugieren su potencial uso alogénico
en tejidos creados por ingeniería de tejidos como la piel o córnea
disminuiría el riesgo de rechazo, sin embargo, son necesarios más
estudios a nivel preclínico para confirmar estos resultados preli-
minares.
AGRADECIMIENTOS
Laboratorio de Citogenética del servicio de Análisis Clínicos
del Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Servicio de Análi-
sis Clínicos (Sección de Citometría/Biopatología tumoral) del Hos-
pital Universitario Virgen de las Nieves.
FINANCIACIÓN PARCIAL
FIS ISC-III and FEDER PI13/02576
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