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Raquel Camacho Luque
Sepsityper® para la identificación rápida de microorganismos
INTRODUCCIÓN
La mortalidad del paciente con sepsis asociada a bacterie-
mia está directamente asociada con la implantación de un trata-
miento antibiótico empírico inadecuado (1). Se estima que entre
un 28 y un 34% de tratamientos empíricos que se instauran para
el tratamiento de una sepsis son inadecuadas (2-4). Por ello, se
necesitan esquemas terapéuticos empíricos optimizados para
contribuir a evitar la aparición y diseminación de resistencias mi-
crobianas debidas a un uso inadecuado de antimicrobianos en
diversas situaciones clínicas, así como mejoras en la rapidez y
calidad del diagnóstico etiológico de bacteriemia. Entre las inno-
vaciones metodológicas, la espectrometría de masas permite ha-
cer un diagnóstico etiológico rápido en la rutina asistencial para
el diagnóstico de la bacteriemia.
La espectrometría de masas ha sido utilizada en distintos
aspectos relacionados con la identificación bacteriana desde
1980 (5-9), pero a partir de 2009, el sistema MALDI-TOF MS®
(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight) co-
mienza a utilizarse para el diagnóstico microbiológico, gracias a
un protocolo de identificación de microorganismos basado en su
perfil proteómico. Diversos autores han comparado esta tecno-
logía tanto con los métodos tradicionales del laboratorio de mi-
crobiología (10-11), como con equipos basados en reacción de
la cadena polimerasa a tiempo real tales como LightCycler Septi-
Fast, Roche Molecular Systems (PCR) (12-13). Frente a las prue-
bas bioquímicas, la rapidez es la gran ventaja de la tecnología de
MALDI-TOF, mientras que frente a los métodos rápidos de PCR, la
menor laboriosidad permite mejorar los flujos de trabajo en los
laboratorios asistenciales, y su menor coste económico permite
mejoras en las medidas de contención del gasto.
La aplicación de esta tecnología al estudio de los hemocul-
tivos permite hacer el diagnóstico etiológico de la bacteriemia en
minutos a partir del momento en que se positivizan los frascos,
permitiendo por tanto hacer un tratamiento antibiótico dirigido
a través de la identificación del microorganismo causal, con el
consiguiente beneficio para el paciente.
En nuestro estudio presentamos los resultados de la imple-
mentación de un esquema de diagnóstico etiológico rápido de
bacteriemia basado en la utilización del kit Sepsityper® seguido
de la espectrometría de masas MALDITOF-MS®, para la identi-
ficación rápida de microorganismos a partir de hemocultivos
positivos, determinando el grado de concordancia de resultados
respecto a los métodos clásicos de diagnóstico microbiológico
del agente etiológico de bacteriemia, y el beneficio en tiempo
de adelanto que ofrece esta tecnología a la hora de permitir
establecer un tratamiento antibiótico adecuado en un paciente
séptico grave.
MATERIAL Y MÉTODOS
Durante un periodo de tiempo de diez meses se compara-
ron los resultados de 379 frascos de hemocultivos (BacT/ALERT®,
Biomérieaux) con crecimiento bacteriano positivo correspon-
dientes a 166 pacientes hospitalizados en el Hospital Universi-
tario San Cecilio. Los frascos de hemocultivo positivos procedían
de distintas tomas de pacientes (en condiciones atmosféricas de
aerobiosis y anaerobiosis) durante la evolución clínica del pa-
ciente.
La distribución de los pacientes fue la siguiente: 15 pacien-
tes pediátricos y 151 pacientes adultos (90.96% de la muestra),
de los cuales el 64.45% fueron mujeres (107/166), con una me-
diana de edad de 55 años (37-71). La totalidad de las muestras
pediátricas procedieron de la Unidad de Cuidados Intensivos
Pediátricos del hospital, mientras que las 151 muestras de pa-
cientes adultos analizadas, tuvieron la siguiente distribución por
Servicios: 44.37% procedieron del área de urgencias externas
(67/151); 54/151 procedían de áreas no quirúrgicas (35.76%); y
30 pacientes estudiados estaban hospitalizados en áreas quirúr-
gicas (14/151) o UCI del hospital (22/151, 14.5%).
Todas las muestras fueron procesadas según el algoritmo
diagnóstico para el estudio de bacteriemia de nuestro labora-
torio: tinción de gran a los frascos positivos y posterior reaisla-
miento en los medios de cultivo adecuados. La identificación de
los microorganismos se realizó mediante WIDER® para bacilos
GRAM negativo y cocos GRAM positivos (F. Soria-Melguizo), VI-
TEK-2® para levaduras (Biomérieaux); y API ANA para bacterias
anaerobias (Biomérieaux).Para la identificación de estreptoco-
cos y neumococos se utilizó la prueba de susceptibilidad a la ba-
citracina y a la optoquina.
De forma paralela, los frascos positivos se utilizaron para su
procesamiento directo para identificación por el sistema de es-
pectrometría de masas MALDITOF-MS® -MS (Bruker), utilizando
el kit Sepsityper® (Bruker), para ello utilizamos 1 ml de hemo-
cultivo, lo sometemos a un proceso de lisis con solución LYSIS
BUFFER (LB), centrifugamos y lavamos con la solución WASHING
BUFFER (WB). Posteriormente se añade al pellet 300 µl de agua
HPLC y 900 µl de alcohol. Centrifugamos el eppendorf a 16000
rpm y añadimos ácido fórmico y acetonitrilo. Finalmente centri-
fugar y depositar 1µl del sobrenadante en la pletina proporcio-
nada por el fabricante. Añadir 1µl de matriz (ácido -alfa
-ciano-
4-hidroxicinámico
) y hacer la lectura automatizada en el sistema
MS MALDITOF® Autoflex III (Bruker Daltonics), el cual posee un
software (FlexAnalysis Biotyper 3.3 (Bruker Daltonik) que analiza
los distintos perfiles proteínicos obtenidos y puntúa automáti-
camente con scores de 0 a 3 en función de la fiabilidad de la
identificación obtenida, siendo considerada como una identifica-
ción no fiable a nivel de género ni de especie del microorganis-
mo cuando se obtiene un score inferior al 1,699. Identificación
probable a nivel de género si se obtiene un score entre 1,700 y
1,999. Identificación segura a nivel de género y probable a ni-
vel de especie si el score está comprendido entre 2,000 y 2,299.
Y alta probabilidad de identificación de especie si el score está
comprendido entre 2,300 y 3,000.
Los datos obtenidos se han analizado mediante distribu-
ción de frecuencias absolutas y relativas. Para las variables con-
tinuas se presenta el número de observaciones válidas así como
estadísticas que describan el promedio y la distribución de la dis-
tribución (media ± desviación estándar). Para la estimación de
la correlación entre técnicas se estima el Índice de Correlación
Kappa de los resultados obtenidos por ambas técnicas, el cual
establece una fortaleza de concordancia de resultados excelente
cuando el índice es de 0.81-1, bueno si es entre 0.61-0.8, mode-
rado si 0.41-0.6, ligero si 0.21-0.4, y malo si menor de 0.2.
RESULTADOS
La distribución de los aislamientos estudiados en los 166
pacientes fue de un 25.3% de Bacilos GRAM Negativos (BGN,
n=42), y de un 74.7% de Cocos GRAM Positivos (CGP, n=124) de
los cuales 89 fueron bacteriemias causadas por Estafilococos
coagulasa negativo (ECN), 13 por
S. aureus
, 4 por microorganis-
mos pertenecientes al género
Enterococcus
, 6 pertenecieron al
grupo
St. viridans
y 1
St. pneumoniae
. Finalmente se diagnostica-
ron 11 bacteriemias causadas por otros microorganismos GRAM
positivo: 1
Corynebacterium spp
, 2 casos de
Bacillus circulans
,
1 bacteriemia por
Listeria monocytogenes
; 4 por
Micrococcus
luteus
; 2
Clostridium perfringens
y un
Propinebacterium acnés
.
La concordancia global de resultados entre la identificación
por MS MALDITOF® y la identificación tradicional ha sido del
98.7% respecto al género de los microorganismos implicados, y
del 95.8 % respecto a su especie. Estos datos, cuando se separan
entre microorganismos GRAM negativos (GN) y GRAM positivos
(GP), pasan a 100% de concordancia en género en los GN (95.2%
de concordancia en especie); y del 98.2% de concordancia en
género en GP (82.5% en especie).
La correlación en la identificación de los bacilos GRAM ne-