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Felipe Alconchel-Gago
Enfermedad de Huntington y ácido oleico
lipoperoxidación del cerebro (niveles de malondialdehído,
MDA + 4-hydroxyalquenales, 4-HDA). Para ello se utilizó el kit
comercial LPO-586 (Bioxytech, Oxis International, Portland, OR,
USA). Este método usa un reactivo cromógeno que reacciona
con los productos de peroxidación lipídica a 45 ± 1º C. Los
niveles de peroxidación lipídica se expresaron como nanomoles
deMDA + 4-HDA por miligramo de proteína (nmol/mg proteína),
y la absorbancia se midió en un espectrofotómetro UV-1603
(Shimadzu) a 586 nm.
Contenido de glutatión reducido
El glutatión (GSH) es un importante antioxidante
intracelular, congran relevanciaentre los sistemas antioxidantes.
El contenido de GSH en el cerebro se midió usando reactivos de
Oxis International (GSH-400 kits, Oxis International, Portland,
OR, USA), expresado como nanomoles de GSH por miligramo
de proteína (nmol/mg de proteína). La absorbancia se evaluó a
400 nm en un espectrofotómetro (UV-1603; Shimadzu).
Actividad de la glutatión peroxidasa
Para la determinación de la actividad glutatión peroxidasa
se usó un volumen de 25 μL de muestra, y los siguientes
reactivos: tampón fosfato 0,1 M hasta completar un volumen
de 880 μL, 51 μL de glutatión reductasa, 133 μL de glutatión
reducido (30,7 mg/10 mL tampón fosfato 0,1 M), y 100 μL de
NADPH (12,5 mg/10 mL [10 mg bicarbonato/10 mL agua]). La
mezcla se incubó durante 3 minutos a 37 ºC, y unos segundos
antes de leer se añadió 100 μL de ter-Butyl hidroperóxido
(15,5 μL/10 mL tampón fosfato 10 M). La absorbancia se
evaluó a 340 nm a tiempo 0 y a los 5 minutos mediante
espectrofotometría (UV-1603; Shimadzu). Los resultados se
expresan como unidad de actividad (UA) por miligramo de
proteína. El estándar usado fue glutatión peroxidasa (Sigma,
G-4013, 1UN) (20).
Cuantificación de proteínas
La concentración de proteínas se midió mediante la
reacción de Bradford, usando albúmina sérica bovina como
estándar. Laabsorbancia seevaluómedianteespectrofotometría
(espectrofotómetro UV-1603; Shimadzu).
Análisis estadísticos
El análisis estadístico de los resultados se realizó con el
programa estadístico SPSS 12.0
®
(SPSS Iberica, Madrid, España).
Para evaluar la significancia estadística se aplicó un análisis de
varianza (ANOVA) de una vía, con la prueba de corrección HSD
de Tukey. El nivel de significancia estadística fue establecido en
P < 0,05. Todos los resultados son expresados como media ±
desviación estándar (DE).
RESULTADOS
El 3NP causó un aumento en los productos de oxidación
lipídica y de la actividad de la GPx en el cerebro (P<0,01 y P<
0,05 respectivamente), así como una disminución en los niveles
de glutatión reducido (P<0,05) (Tabla 1, Figuras 1-3).
La administración del ácido oleico o hidroxitirosol tras
la inyección con 3NP provocó la disminución en los niveles
de productos de lipoperoxidación (P<0,01)(Tabla 1, Figura 1),
y una recuperación en el contenido de GSH (P<0,05)(Tabla 1,
Figura 2). Por su parte, ninguna de estos agentes desencadenó
cambios significativos en los niveles de actividad de la GPx
(Tabla 1, Figura 3).
Asimismo, la administración conjunta de ambas sustancias
no intensificó su efecto protector respecto del tratamiento
sencillo, aunque sí protegió en la misma intensidad que ambas
moléculas de forma independiente.
L P O
(nmol/mg
proteína)
GSH (nmol/
mg proteína)
GPx
(UA/mg
proteína)
Control
4,0 65,7 0,12
3NP
6,2
c
55,2
b
0,16
b
3NP + AO 4,4
f
61,8
f
0,16
3NP + HT
4,2
e
64,0
f
0,15
3NP + AO
+ HT
3,4
e
62,3
f
0,15
Figura 1. Efecto del hidroxitirosol (HT) y ácido oleico (AO) sobre
los niveles de los productos de lipoperoxidación cerebrales en
un modelo similar a enfermedad de Huntington inducido por
ácido 3-nitropropiónico (3NP) en la rata Wistar. Las barras
representan las medias ± DE. **P<0.01 vs control; ••P<0.01 vs
3NP; •P<0.05 vs 3NP.
Tabla 1 Cambios inducidos por el ácido 3-nitropropiónico (3NP),
ácido oleico (AO) e hidroxitirosol (HT). Los datos representa las
medias.
b
P < 0,01 vs control;
c
P < 0,05 vs control;
e
P<0.01 vs 3NP;
f
P<0.05 vs 3NP.
Figura 2. Efecto del hidroxitirosol (HT) y ácido oleico (AO) sobre los
niveles de glutatión reducido (GSH) cerebrales en un modelo similar
a enfermedad de Huntington inducido por ácido 3-nitropropiónico
(3NP) en la rata Wistar. Las barras representan las medias ± DE.
*P<0.05 vs control; •P<0.05 vs 3NP.