Revista nº 798

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86 Ana Fernández González
Optimización del cultivo de queratinocitos para el desarrollo de un modelo de piel artificial humana
INTRODUCCIÓN:
La ingeniería tisular (1)(2) constituye un conjunto de téc-
nicas y métodos que permiten diseñar y generar en el labo-
ratorio sustitutos tisulares, tejidos artificiales o constructos
de origen autólogo o alogénico a partir de células madre y
biomateriales.
La piel (3) (4), es el mayor órgano funcional del cuerpo
humano; cubre un área de 1,5 a 2 metros cuadrados en
un adulto medio. La piel sana representa una barrera
contra agresiones mecánicas, químicas, tóxicos, calor, frío,
radiaciones UV y microorganismos patógenos. Además,
la piel es esencial para el mantenimiento del equilibrio de
fluidos corporales, el mantenimiento del equilibrio térmico
y la transmisión de una gran cantidad de información
externa que accede al organismo por el tacto, la presión, la
temperatura y los receptores del dolor (5).
Desde fuera hacia dentro (6), se distinguen tres capas de
tejido: epidermis, dermis e hipodermis. La epidermis (7) es
un epitelio plano poliestratificado y queratinizado que cubre
la totalidad de la superficie corporal. Es la capa de la piel con
mayor número de células y con una dinámica de recambio
extraordinariamente grande. El componente celular más
importante de la epidermis son los queratinocitos, que se
distribuyen en varios estratos (basal, espinoso, granuloso
y córneo) y que tienen capacidad para sintetizar queratina,
proteína filamentosa con una función protectora.
La piel humana puede estar afectada por múltiples pa-
tologías y las lesiones pueden ser congénitas, traumáticas,
inflamatorias o infecciosas. Por lo tanto, el desarrollo de un
sustituto eficiente de piel humana es uno de los principales
desafíos que enfrenta la ingeniería de tejidos.
Para generar un modelo de piel humana artificial (8)(9)
(10), es necesario desarrollar un sustituto de estroma dér-
mico con fibroblastos humanos inmersos en su interior (11)
y posteriormente, cultivar los queratinocitos en la parte su-
perior (12)(13).
El principal limitante en el desarrollo de un modelo de
piel humana autóloga para el tratamiento de quemaduras de
gran extensión (14), es la obtención de un gran número de
queratinocitos que formen parte de la capa epitelial.
Para la expansión de queratinocitos es necesario la uti-
lización de células alimentadoras que actúen como feeder.
Para su uso, la capacidad proliferativa de estas células debe
ser inhibida por radiación. Sin embargo, estas células man-
tienen su actividad metabólica, produciendo los factores
de crecimiento requeridos por los queratinocitos; siendo la
función de esta capa alimentadora actuar como un soporte
celular in vitro.
En el año 1975, Rheinwald y Green (15) establecieron
el método estándar para la expansión de los queratinocitos
humanos primarios en cultivo, mediante el uso de un feeder
de fibroblastos 3T3 de ratón irradiados letalmente, que es-
timulan la adhesión y la proliferación de los queratinocitos.
La elección de una capa alimentadora de fibroblastos se
presenta como la mejor opción para la expansión a gran es-
cala de los queratinocitos de piel autóloga que se va a utilizar
para el tratamiento de pacientes con quemaduras graves. En
un contexto clínico, el uso de células de origen humano en
lugar de una capa alimentadora de origen murino es necesa-
ria para reducir el riesgo de introducir antígenos animales y
virus desconocidos.
El objetivo de este trabajo, es comparar el rendimiento
a tres semanas de tres líneas celulares que actúan como capa
alimentadora en el cultivo de queratinocitos: los fibroblastos
murinos 3T3, los fibroblastos dérmicos humanos y las células
mesenquimales troncales derivadas de tejido adiposo.
METODOLOGÍA:
1. Obtención de células utilizadas como capa alimenta-
dora: feeder
1.1 Fibroblastos 3T3 de origen murino:
Se utilizaron dos líneas celulares de fibroblastos 3T3 de
origen murino, una perteneciente a la colección Europea (3T3
Swiss Albino, Sigma, Ref. 85022108-1V, Lote CB2657) y otra
de la colección Americana (3T3 Swiss Albino, ATCC, CCL-92,
60770553) adquiridas por la Unidad de Producción Celular e In-
geniería Tisular (UPCIT) del Complejo Hospitalario Universitario
de Granada. Ambas líneas de fibroblastos 3T3 se descongelaron
y se expandieron con medio de cultivo específico para el cul-
tivo de fibroblastos (MF): DMEM sin Rojo Fenol (Sigma), 10%
Suero Fetal Bovino (Sigma), 1% de Glutamina 200 mM (Sigma) y
Gentamicina 96 µg/ml (Normon). Se estableció un banco celular
maestro (BCM) y un banco celular de trabajo (BCT).
1.2 Fibroblastos dérmicos humanos (FH):
Los fibroblastos dérmicos humanos (FH) se obtuvieron a
partir de tejido dérmico de piel abdominal, sobrante de cirugías
plásticas abdominales previo consentimiento informado del pa-
ciente en cumplimiento de los requisitos de donación de células
y tejidos humanos (Real Decreto-ley 9/2014, de 4 de Julio). El
tejido se procesó mecánicamente con ayuda de bisturí y pin-
zas, posteriormente se incubó en una solución de 2 mg/ml de
colagenasa tipo I (Gibco) durante 18-24 horas. Transcurrido el
tiempo de digestión enzimática, se neutralizó con el doble de
volumen de MF y se filtró a través de un filtro estéril de 100 µm.
La solución resultante, se centrifugó a 300g durante 10 minutos.
Mediante la solución de Türk (Sigma) se determinó el número
de células, y la viabilidad celular se estableció utilizando el mé-
todo Azul Tripán (Sigma). Las células se sembraron a una densi-
dad de 100.000-140.000 células/cm2 con medio MF.
1.3 Células mesenquimales troncales derivadas de tejido
adiposo (ADMSC):
Las células mesenquimales troncales derivadas de tejido
adiposo (ADMSC) se obtuvieron de tejido adiposo sobrante de
cirugías plásticas abdominales a través del Biobanco del Sistema
Público Andaluz previo consentimiento informado del paciente
en cumplimiento de los requisitos de donación de células y teji-
dos humanos (Real Decreto-ley 9/2014, de 4 de Julio). El tejido
adiposo se procesó mecánicamente con ayuda de bisturí y pin-
zas, posteriormente se pasó por un molinillo estéril, se incubó
en una solución de 2 mg/ml de colagenasa A (Roche) durante 2
horas en agitación. Después de la digestión enzimática, la solu-
ción de digestión se neutralizó con el doble de volumen de MF,
se centrifugó a 300g durante 10 minutos y se filtró a través de
una malla de 100 µm. La solución filtrada, se centrifugó a 800g
durante 10 minutos. El contaje celular se realizó mediante la so-
lución de Türk (Sigma) y la viabilidad celular se determinó utili-
zando el método Azul Tripán (Sigma). Las células se sembraron a
una densidad de 100.000 células/cm2 con medio MF.
2. Mantenimiento de feeder en cultivo
Las células que actuaron como feeder se mantuvieron en
cultivo durante el proceso completo de expansión de queratino-
citos, trabajando en superficies comprendidas entre frasco de
cultivo T25 (25 cm2) hasta factoría de 4 pisos (2520 cm2), bajo
condiciones estándar de cultivo: 37ºC, 5% de CO2. El pase celu-
lar se estableció al alcanzar las células en cultivo una confluen-
cia superior al 80%. Para el despegue celular se retiró el medio
de cultivo MF, se realizó un lavado con DPBS y posteriormente
se incubó con TrypLE Select 1X (Gibco) en proporción 1ml por
cada 25 cm2 de superficie de cultivo. La solución se neutralizó
con el doble de volumen de MF, se centrifugó a 800g y se reali-
zó el contaje de células totales y viabilidad celular mediante el
método Azul Tripán, respectivamente. Las células obtenidas se
sembraron a una densidad de 2500-5000 células por cm2 con
medio MF.